通过PCR直接扩增谷氨酸脱氢酶（GDH）基因和丙酮酸羧酰酶（PYC）基因。对产琥珀酸曼海姆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）基因进行密码子优化并合成。为了构建供整合的供体DNA片段，通过重叠PCR扩增上下游同源臂和靶序列并融合在一起。使用CRISPR RGEN工具设计了每个靶点特异的20 bp间隔区并使用ClonExpress II一步克隆试剂盒连接到质粒pGRB中。
参考文献：Fan X, Zhang T, Ji Y, Li J, Long K, Yuan Y, Li Y, Xu Q, Chen N, Xie X. Pathway engineering of Escherichia coli for one-step fermentative production of L-theanine from sugars and ethylamine. Metab Eng Commun. 2020 Nov 6;11:e00151.
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通过PCR直接扩增谷氨酸脱氢酶（GDH）基因和丙酮酸羧酰酶（PYC）基因。对产琥珀酸曼海姆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK）基因进行密码子优化并合成。为了构建供整合的供体DNA片段，通过重叠PCR扩增上下游同源臂和靶序列并融合在一起。使用CRISPR RGEN工具设计了每个靶点特异的20 bp间隔区并使用ClonExpress II一步克隆试剂盒连接到质粒pGRB中。
参考文献：Fan X, Zhang T, Ji Y, Li J, Long K, Yuan Y, Li Y, Xu Q, Chen N, Xie X. Pathway engineering of Escherichia coli for one-step fermentative production of L-theanine from sugars and ethylamine. Metab Eng Commun. 2020 Nov 6;11:e00151.
