为了构建pXMJ19-SB-hemA的重组表达载体，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增了编码鼠伤寒沙门氏菌LT2谷氨酰-tRNA还原酶的hemA。为了保持谷氨酰-tRNA还原酶的稳定性，使用特异性引物将两个赖氨酸残基（KK）插入hemA的三和四的氨基酸残基中。使用RBS计算器设计了具有不同转变起始强度的合成RBS，并使用特异性引物将其添加到hemA的上游。将PCR产物纯化、消化并插入pXMJ19的多个克隆位点。为了实现hemA和hemL的共表达，扩增大肠杆菌DH5ɑ的hemL，通过重叠PCR将其插入hemA末端，并通过酶切和连接克隆到pXMJ19中。对于hemB的染色体RBS变化，使用合理设计的引物将RBS序列插入hemB上游和下游片段之间的重叠区域。通过标准化分子克隆构建质粒pK18-hemB100和pK18hemB500。为了将rhtA整合到C.glutamicum的ncgl1221区域，从大肠杆菌DH5ɑ的基因组DNA中扩增rhtA，并使用Gibson组装将其插入质粒pK18-△ncgl1221中，从而产生质粒pK18--△ncgl1221-rhtA。所有重组质粒均通过电穿孔转化为工程谷氨酸杆菌S9114衍生菌株。
参考文献：Zhang B, Ye BC. Pathway engineering in Corynebacterium glutamicum S9114 for 5-aminolevulinic acid production. 3 Biotech. 2018 May;8(5):247.
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为了构建pXMJ19-SB-hemA的重组表达载体，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增了编码鼠伤寒沙门氏菌LT2谷氨酰-tRNA还原酶的hemA。为了保持谷氨酰-tRNA还原酶的稳定性，使用特异性引物将两个赖氨酸残基（KK）插入hemA的三和四的氨基酸残基中。使用RBS计算器设计了具有不同转变起始强度的合成RBS，并使用特异性引物将其添加到hemA的上游。将PCR产物纯化、消化并插入pXMJ19的多个克隆位点。为了实现hemA和hemL的共表达，扩增大肠杆菌DH5ɑ的hemL，通过重叠PCR将其插入hemA末端，并通过酶切和连接克隆到pXMJ19中。对于hemB的染色体RBS变化，使用合理设计的引物将RBS序列插入hemB上游和下游片段之间的重叠区域。通过标准化分子克隆构建质粒pK18-hemB100和pK18hemB500。为了将rhtA整合到C.glutamicum的ncgl1221区域，从大肠杆菌DH5ɑ的基因组DNA中扩增rhtA，并使用Gibson组装将其插入质粒pK18-△ncgl1221中，从而产生质粒pK18--△ncgl1221-rhtA。所有重组质粒均通过电穿孔转化为工程谷氨酸杆菌S9114衍生菌株。
参考文献：Zhang B, Ye BC. Pathway engineering in Corynebacterium glutamicum S9114 for 5-aminolevulinic acid production. 3 Biotech. 2018 May;8(5):247.
