来自嗜盐芽孢杆菌BA-2008的基因csiD是密码子优化过的。使用质粒或基因组DNA作为模板，用ALLin HiFi DNA聚合酶扩增DNA序列。ldcC基因是从载体pVWEx1-ldcC中扩增出来的，而不同的csiD基因是从相应生物体的基因组DNA中扩增出来，并使用相应的引物通过Gibson Assembly组装到BamHI消化的pVWEx1中。通过转化将构建的质粒转移到谷氨酸梭菌中。对于缺失，用BamHI消化的质粒pK19mobsacB使用Gibson Assembly与sucE基因侧翼的扩增DNA片段（cg2425）组装，并转移到大肠杆菌S17-1中。为了用更强的tuf启动子替换天然启动子，从谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中扩增tuf启动因子和sucE启动子的侧翼区域，并与消化的质粒pK19mobsacB组装。为了获得更高的表达率，sucE的起始密码子从GTG改为ATG，并包括一个优化的核糖体结合位点（RBS）。
参考文献：Prell C, Burgardt A, Meyer F, Wendisch VF. Fermentative Production of l-2-Hydroxyglutarate by Engineered Corynebacterium glutamicum via Pathway Extension of l-Lysine Biosynthesis. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Jan 27;8:630476.
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来自嗜盐芽孢杆菌BA-2008的基因csiD是密码子优化过的。使用质粒或基因组DNA作为模板，用ALLin HiFi DNA聚合酶扩增DNA序列。ldcC基因是从载体pVWEx1-ldcC中扩增出来的，而不同的csiD基因是从相应生物体的基因组DNA中扩增出来，并使用相应的引物通过Gibson Assembly组装到BamHI消化的pVWEx1中。通过转化将构建的质粒转移到谷氨酸梭菌中。对于缺失，用BamHI消化的质粒pK19mobsacB使用Gibson Assembly与sucE基因侧翼的扩增DNA片段（cg2425）组装，并转移到大肠杆菌S17-1中。为了用更强的tuf启动子替换天然启动子，从谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中扩增tuf启动因子和sucE启动子的侧翼区域，并与消化的质粒pK19mobsacB组装。为了获得更高的表达率，sucE的起始密码子从GTG改为ATG，并包括一个优化的核糖体结合位点（RBS）。
参考文献：Prell C, Burgardt A, Meyer F, Wendisch VF. Fermentative Production of l-2-Hydroxyglutarate by Engineered Corynebacterium glutamicum via Pathway Extension of l-Lysine Biosynthesis. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Jan 27;8:630476.
