对于pta缺失，分别使用引物d-pta-FU/L和d-pta-BU/L从枯草芽孢杆菌基因组中扩增其上下游片段，通过融合PCR将这两个片段融合并扩增。然后用SphI-KpnI消化融合片段（pta FB），并将其连接到pCU的相同消化位点以产生pCU-ptaFB。

用相应的ldh缺失引物扩增ldhFB融合片段。用AatII消化，将片段连接到pCU的相应位点，得到质粒pCU-ldhFB。对于无标记基因过表达，通过pPSDBUE的引物O-P43-U和O-alsSD-L对枯草芽孢杆菌强启动子P43和alsS和alsD基因片段一起进行扩增，然后放置在pCU-bdhAFB中bdhA的上游和下游片段之间，产生pCU-bdh-A-PSD，用于枯草芽孢杆菌基因组中alsSD的过表达。用引物从枯草芽孢杆菌染色体DNA中扩增出P43启动子，用BamHI-SmaI消化，并连接到pUC18的匹配位点，得到pUC18-P43。然后用引物将alsS和alsD基因一起扩增，用SmaI-BamHI消化，并连接到用相同酶消化的pUC18-P43上，形成pUC18-P43-SD。接下来，用引物扩增udhA基因，用XbaI-SalI消化，连接到pUC18-P4 3-SD的相同位点，形成pUC18-P43-SDU。随后，用BamHI消化引物扩增的budC基因，并将其连接到用相同限制性内切酶切位点消化的pUC18-P43-SDU上，得到pUC18-P43-SDBU。最后，用引物从pHP13中扩增红霉素抗性基因erm，并将其连接到AatII消化的pUC18-P43-SDBU上，得到pPSDBUE。用引物从肺炎克雷伯菌CICC10011中通过PCR扩增budC。这些片段用限制性内切酶KpnI-BamHI消化，并连接到KpnI-BanHI消化的pHP13-P43上，得到pHP13-P43-budC。用引物S-budC U/L扩增budC基因，用BamHI-XbaI消化，并将其连接到pUC18-SP的匹配位点上，形成pUC18-SP-budC。

参考文献：Fu J, Huo G, Feng L, Mao Y, Wang Z, Ma H, Chen T, Zhao X. Metabolic engineering of Bacillus subtilis for chiral pure meso-2,3-butanediol production. Biotechnol Biofuels. 2016 Apr 19;9:90.