使用启动子PbacA替换ilvBHC-leuABCD操纵子、ilvD、yvmC-cypX操纵子和leuS的原始启动子，使用CRISPR-Cas9n工具构建基因过表达菌株。用相应的引物扩增了无核糖体结合位点（RBS）的P43启动子与单导向RNA（sgRNA）片段、PbacA启动子以及PilvBHC-leuABCD的上下游同源臂。然后通过剪接重叠延伸（SOE）-PCR将这些片段融合，并使用EcoRI和XbaI限制性位点插入pHY300，构建名为pGRNA-PbacA的质粒。然后通过剪接重叠延伸-PCR将这些片段融合，插入到pHY300的EcoRI和XbaI限制性位点，构建名为pGRNA-PbacA的质粒。然后将pGRNA-PbacA电转化进DWc9n*。通过相同的方法获得了ilvD、yvmC-cypX操纵子和leuS启动子替换菌株。通过SOE-PCR扩增并融合地衣芽孢杆菌DW2的PbacA启动子、yvmA基因和amyL终止子，将融合片段插入pHY300载体的限制性位点BamHI和XbaI得到pHY-yvmA。将pHY-yvmA电转移到地衣芽孢杆菌菌株中，构建yvmA过表达菌株。
参考文献：Wang S, Wang H, Zhang D, Li X, Zhu J, Zhan Y, Cai D, Wang Q, Ma X, Wang D, Chen S. Multistep Metabolic Engineering of Bacillus licheniformis To Improve Pulcherriminic Acid Production. Appl Environ Microbiol. 2020 Apr 17;86(9):e03041-19.
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使用启动子PbacA替换ilvBHC-leuABCD操纵子、ilvD、yvmC-cypX操纵子和leuS的原始启动子，使用CRISPR-Cas9n工具构建基因过表达菌株。用相应的引物扩增了无核糖体结合位点（RBS）的P43启动子与单导向RNA（sgRNA）片段、PbacA启动子以及PilvBHC-leuABCD的上下游同源臂。然后通过剪接重叠延伸（SOE）-PCR将这些片段融合，并使用EcoRI和XbaI限制性位点插入pHY300，构建名为pGRNA-PbacA的质粒。然后通过剪接重叠延伸-PCR将这些片段融合，插入到pHY300的EcoRI和XbaI限制性位点，构建名为pGRNA-PbacA的质粒。然后将pGRNA-PbacA电转化进DWc9n*。通过相同的方法获得了ilvD、yvmC-cypX操纵子和leuS启动子替换菌株。通过SOE-PCR扩增并融合地衣芽孢杆菌DW2的PbacA启动子、yvmA基因和amyL终止子，将融合片段插入pHY300载体的限制性位点BamHI和XbaI得到pHY-yvmA。将pHY-yvmA电转移到地衣芽孢杆菌菌株中，构建yvmA过表达菌株。
参考文献：Wang S, Wang H, Zhang D, Li X, Zhu J, Zhan Y, Cai D, Wang Q, Ma X, Wang D, Chen S. Multistep Metabolic Engineering of Bacillus licheniformis To Improve Pulcherriminic Acid Production. Appl Environ Microbiol. 2020 Apr 17;86(9):e03041-19.
