以C.crenatum SYPA5-5基因组为模板，使用PbutA1F、PbutA3R和PbutA2R、PbutA4F引物进行第一轮PCR，得到两个PCR产物。其次，通过融合重叠延伸PCR两个PCR产物获得缺失的基因片段ΔbutA。获得缺失基因片段Δldh的方法与上述相同。将缺失基因片段ΔbutA和Δldh分别连接到pK18obsacB自杀质粒上。在大肠杆菌JM109中构建了重组质粒pK18-ΔbutA和pK18-△ldh。根据报道的方法，将质粒pK18-ΔbutA电穿孔到C.cre natum中。ldh基因缺失菌株的构建方法与上述相同。分别获得了基因缺失的克氏乳杆菌ΔbutA和克氏乳球菌Δldh菌株。将构建的同源整合质粒pK18-Δldh电穿孔到C.crenatumΔbutA中，经过两次同源重组，获得butA和ldh双基因缺失型重组菌株C.crenatuΔbutAΔldh。
参考文献：Zhang X, Han R, Bao T, Zhao X, Li X, Zhu M, Yang T, Xu M, Shao M, Zhao Y, Rao Z. Synthetic engineering of Corynebacterium crenatum to selectively produce acetoin or 2,3-butanediol by one step bioconversion method. Microb Cell Fact. 2019 Aug 6;18(1):128.
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以C.crenatum SYPA5-5基因组为模板，使用PbutA1F、PbutA3R和PbutA2R、PbutA4F引物进行第一轮PCR，得到两个PCR产物。其次，通过融合重叠延伸PCR两个PCR产物获得缺失的基因片段ΔbutA。获得缺失基因片段Δldh的方法与上述相同。将缺失基因片段ΔbutA和Δldh分别连接到pK18obsacB自杀质粒上。在大肠杆菌JM109中构建了重组质粒pK18-ΔbutA和pK18-△ldh。根据报道的方法，将质粒pK18-ΔbutA电穿孔到C.cre natum中。ldh基因缺失菌株的构建方法与上述相同。分别获得了基因缺失的克氏乳杆菌ΔbutA和克氏乳球菌Δldh菌株。将构建的同源整合质粒pK18-Δldh电穿孔到C.crenatumΔbutA中，经过两次同源重组，获得butA和ldh双基因缺失型重组菌株C.crenatuΔbutAΔldh。
参考文献：Zhang X, Han R, Bao T, Zhao X, Li X, Zhu M, Yang T, Xu M, Shao M, Zhao Y, Rao Z. Synthetic engineering of Corynebacterium crenatum to selectively produce acetoin or 2,3-butanediol by one step bioconversion method. Microb Cell Fact. 2019 Aug 6;18(1):128.
