设计特异性引物以扩增Z.mobilis pdc和adhB基因。使用引物1和2从载体pLOI276中扩增出Z.mobilis pdc基因。将1.7kb的PCR扩增片段克隆到PCR-TOPO中，获得载体IpTOPO-pdc。在第一次PCR中，使用引物从载体pLOI284中扩增出adhB基因与包括一半的吉氏苏云杆菌cryIIIA基因的终止子cryIIAt；在第二次PCR中扩增adhB基因与完整的终止子；将该PCR片段克隆到PCR-TOPO中，产生pTOPO-adh-term。pdc和adhB基因从载体pTOPO-pdc-adh-term复制并纯化为2.88-kbp EcoRI-NaeI片段。将该片段连接到载体pSG-PLK的EcoRI-HincII位点，获得载体pSG-operon。该质粒含有pdc和adhB基因接着转录终止子cryIIAt和氯霉素抗性盒（cat）。扩增枯草芽孢杆菌的ldh基因，并将其克隆到质粒pUC19的HincII位点，构建pUC-ldh。将无启动子的pdc和adhB基因、cryIIAt和cat基因纯化为来自载体pSG操纵子的4.5-kbp钝性处理的AccI片段，并连接到pUC-ldh中ldh基因的EcoRV位点；得到的质粒是pUC ldh：：operonCM。使用自杀载体pUC ldh：操纵子CM转化枯草芽孢杆菌CH1细胞，所得菌株命名为BS35。
参考文献：Romero S, Merino E, Bolívar F, Gosset G, Martinez A. Metabolic engineering of Bacillus subtilis for ethanol production: lactate dehydrogenase plays a key role in fermentative metabolism. Appl Environ Microbiol. 2007 Aug;73(16):5190-8.
技术服务 Technology Services
联系我们
CONTACT US
-
0574-87917803
服务热线 -
testobio@163.com
邮箱
设计特异性引物以扩增Z.mobilis pdc和adhB基因。使用引物1和2从载体pLOI276中扩增出Z.mobilis pdc基因。将1.7kb的PCR扩增片段克隆到PCR-TOPO中，获得载体IpTOPO-pdc。在第一次PCR中，使用引物从载体pLOI284中扩增出adhB基因与包括一半的吉氏苏云杆菌cryIIIA基因的终止子cryIIAt；在第二次PCR中扩增adhB基因与完整的终止子；将该PCR片段克隆到PCR-TOPO中，产生pTOPO-adh-term。pdc和adhB基因从载体pTOPO-pdc-adh-term复制并纯化为2.88-kbp EcoRI-NaeI片段。将该片段连接到载体pSG-PLK的EcoRI-HincII位点，获得载体pSG-operon。该质粒含有pdc和adhB基因接着转录终止子cryIIAt和氯霉素抗性盒（cat）。扩增枯草芽孢杆菌的ldh基因，并将其克隆到质粒pUC19的HincII位点，构建pUC-ldh。将无启动子的pdc和adhB基因、cryIIAt和cat基因纯化为来自载体pSG操纵子的4.5-kbp钝性处理的AccI片段，并连接到pUC-ldh中ldh基因的EcoRV位点；得到的质粒是pUC ldh：：operonCM。使用自杀载体pUC ldh：操纵子CM转化枯草芽孢杆菌CH1细胞，所得菌株命名为BS35。
参考文献：Romero S, Merino E, Bolívar F, Gosset G, Martinez A. Metabolic engineering of Bacillus subtilis for ethanol production: lactate dehydrogenase plays a key role in fermentative metabolism. Appl Environ Microbiol. 2007 Aug;73(16):5190-8.
