使用引物对从WX-02基因组中扩增出5′和3′侧翼序列。用引物Δgdh-A-F和Δgdh-B-R通过剪接重叠延伸PCR（SOE-PCR）连接这两个片段。融合片段（1140 bp）用XbaI和SacI消化，插入T2（2）-ori，产生质粒T2Δgdh。通过电穿孔法用敲除质粒T2Δgdh转化地衣芽孢杆菌WX-02。选取卡那霉素抗性转化体，用引物T2-VF和T2-VR进行PCR验证。用引物从枯草芽孢杆菌168的染色体DNA中PCR扩增出P43启动子。用引物P43-gdh-TamyL-3至6从WX-02基因组DNA中扩增出gdh基因和amyL基因的终止子。通过SOE-PCR将三个片段与引物P43-gdh-TamyL-1和6融合，并克隆到pHY300PLK的XbaI和BamHI位点，形成质粒pHY-gdh。然后，基于先前描述的方法，通过电穿孔将表达载体pHY-gdh转化到地衣芽孢杆菌WX-02Δgdh中。用引物通过PCR验证具有四环素抗性的阳性转化体，并将其命名为WX-02Δgdh/pHY-gdh。
参考文献：Qiu Y, Zhang J, Li L, Wen Z, Nomura CT, Wu S, Chen S. Engineering Bacillus licheniformis for the production of meso-2,3-butanediol. Biotechnol Biofuels. 2016 Jun 2;9:117.
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使用引物对从WX-02基因组中扩增出5′和3′侧翼序列。用引物Δgdh-A-F和Δgdh-B-R通过剪接重叠延伸PCR（SOE-PCR）连接这两个片段。融合片段（1140 bp）用XbaI和SacI消化，插入T2（2）-ori，产生质粒T2Δgdh。通过电穿孔法用敲除质粒T2Δgdh转化地衣芽孢杆菌WX-02。选取卡那霉素抗性转化体，用引物T2-VF和T2-VR进行PCR验证。用引物从枯草芽孢杆菌168的染色体DNA中PCR扩增出P43启动子。用引物P43-gdh-TamyL-3至6从WX-02基因组DNA中扩增出gdh基因和amyL基因的终止子。通过SOE-PCR将三个片段与引物P43-gdh-TamyL-1和6融合，并克隆到pHY300PLK的XbaI和BamHI位点，形成质粒pHY-gdh。然后，基于先前描述的方法，通过电穿孔将表达载体pHY-gdh转化到地衣芽孢杆菌WX-02Δgdh中。用引物通过PCR验证具有四环素抗性的阳性转化体，并将其命名为WX-02Δgdh/pHY-gdh。
参考文献：Qiu Y, Zhang J, Li L, Wen Z, Nomura CT, Wu S, Chen S. Engineering Bacillus licheniformis for the production of meso-2,3-butanediol. Biotechnol Biofuels. 2016 Jun 2;9:117.
