用合适的引物扩增核糖体结合位点（RBS）游离的P43启动子与yvmC-sgRNA片段、amyL终止子以及yvmC的上游和下游同源臂通过SOE-PCR融合，并插入pHY300PLK载体中，构建sgRNA表达质粒pGRNA-05。为了分析高编辑效率和同源臂大小之间的平衡点，扩增0.1、0.2、0.3、0.5和0.7kb的同源臂并插入载体中，相应的质粒分别命名为pGRNA-01、pGRNA-02、pGRNA-03、pGRNA-07和pGRNA-10。使用epr和wprA的上下游同源臂将供体模板拼接在一起。然后将这些片段融合并插入pHY300载体中，构建sgRNA表达质粒pHY300-ΔeprΔwprA。设计了两种特定的sgRNAs来靶向bacABC基因簇的两侧。供体模板包含bacABC基因上游1.0kb和下游1.0kb的DNA序列。将无RBS的P43启动子、sgRNA和同源臂与SOE-PCR融合，将融合片段插入pHY300PLK载体中，构建sgRNA表达载体pHY300-ΔbacABC。
参考文献：Li K, Cai D, Wang Z, He Z, Chen S. Development of an Efficient Genome Editing Tool in Bacillus licheniformis Using CRISPR-Cas9 Nickase. Appl Environ Microbiol. 2018 Mar 1;84(6):e02608-17.
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参考文献：Li K, Cai D, Wang Z, He Z, Chen S. Development of an Efficient Genome Editing Tool in Bacillus licheniformis Using CRISPR-Cas9 Nickase. Appl Environ Microbiol. 2018 Mar 1;84(6):e02608-17.
