以质粒pSK485为模板，通过PCR产生含有两个loxP位点、Pxylp启动子、trpC终止子和Cre重组酶基因的片段。然后，将该片段克隆到pEASY Blunt Zero载体中，以产生质粒pzero-Cre-loxP。使用引物扩增选择标记py-roA基因，并使用Exnase II的无缝克隆技术将其亚克隆到pzero-cre-loxp中，形成pCZ。用来自A.nidulans基因组的引物对0-gpdA/tef-F和0-gpdA/tef-R扩增gpdA/tef启动子，然后将得到的片段亚克隆到pCZ中，生成pCZ01/pCZ02。从A.nidulans基因组中扩增出pyc/mdhC，并亚克隆到pCZ02中，形成pCZ03/pCZ04。为了用gpdA启动子过表达pyc，将该基因亚克隆到pCZ01中，形成pCZ05。
参考文献：Chen Z, Zhang C, Pei L, Qian Q, Lu L. Production of L-Malic Acid by Metabolically Engineered Aspergillus nidulans Based on Efficient CRISPR-Cas9 and Cre-loxP Systems. J Fungi (Basel). 2023 Jun 30;9(7):719.
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以质粒pSK485为模板，通过PCR产生含有两个loxP位点、Pxylp启动子、trpC终止子和Cre重组酶基因的片段。然后，将该片段克隆到pEASY Blunt Zero载体中，以产生质粒pzero-Cre-loxP。使用引物扩增选择标记py-roA基因，并使用Exnase II的无缝克隆技术将其亚克隆到pzero-cre-loxp中，形成pCZ。用来自A.nidulans基因组的引物对0-gpdA/tef-F和0-gpdA/tef-R扩增gpdA/tef启动子，然后将得到的片段亚克隆到pCZ中，生成pCZ01/pCZ02。从A.nidulans基因组中扩增出pyc/mdhC，并亚克隆到pCZ02中，形成pCZ03/pCZ04。为了用gpdA启动子过表达pyc，将该基因亚克隆到pCZ01中，形成pCZ05。
参考文献：Chen Z, Zhang C, Pei L, Qian Q, Lu L. Production of L-Malic Acid by Metabolically Engineered Aspergillus nidulans Based on Efficient CRISPR-Cas9 and Cre-loxP Systems. J Fungi (Basel). 2023 Jun 30;9(7):719.
