用质粒pRL27作为模板，用引物扩增R6K复制起点。将0.6kb的oriR6K片段连接到pGEM-T Easy载体上，以创建质粒pToriR6K。用BspHI/BsaXI消化pToriR6K得到oriR6K片段并将其克隆到质粒pK18obsacB中，以创建自杀质粒pKR6K。使用阴沟肠杆菌的总基因组DNA作为PCR模板，用它们各自的引物扩增budCup和ldhA基因的上游和下游扇形序列，并克隆到pGEM-T Easy载体中，以产生质粒pTBCup和pTBCdown。然后，分别用EcoRI和XbaI/SphI从质粒pTBCup和pTBCdown中消化budC上游和下游片段。将这两个片段连接到用EcoRI和XbaI/SphI消化的pKR6K上，产生pKΔbudC。分别用EcoRI和XbaI/SalI从质粒pTLAup和pTLAdown中消化ldhA上游和下游片段。将这两个片段连接到用EcoRI和XbaI/SalI消化的pKR6K上，产生pKΔldhA。
参考文献：Su HY, Li HY, Xie CY, Fei Q, Cheng KK. Co-production of acetoin and succinic acid by metabolically engineered Enterobacter cloacae. Biotechnol Biofuels. 2021 Jan 19;14(1):26.
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用质粒pRL27作为模板，用引物扩增R6K复制起点。将0.6kb的oriR6K片段连接到pGEM-T Easy载体上，以创建质粒pToriR6K。用BspHI/BsaXI消化pToriR6K得到oriR6K片段并将其克隆到质粒pK18obsacB中，以创建自杀质粒pKR6K。使用阴沟肠杆菌的总基因组DNA作为PCR模板，用它们各自的引物扩增budCup和ldhA基因的上游和下游扇形序列，并克隆到pGEM-T Easy载体中，以产生质粒pTBCup和pTBCdown。然后，分别用EcoRI和XbaI/SphI从质粒pTBCup和pTBCdown中消化budC上游和下游片段。将这两个片段连接到用EcoRI和XbaI/SphI消化的pKR6K上，产生pKΔbudC。分别用EcoRI和XbaI/SalI从质粒pTLAup和pTLAdown中消化ldhA上游和下游片段。将这两个片段连接到用EcoRI和XbaI/SalI消化的pKR6K上，产生pKΔldhA。
参考文献：Su HY, Li HY, Xie CY, Fei Q, Cheng KK. Co-production of acetoin and succinic acid by metabolically engineered Enterobacter cloacae. Biotechnol Biofuels. 2021 Jan 19;14(1):26.
