构建含有阿拉伯糖诱导启动子下的λ-红重组基因、鼠李糖诱导启动子下的翻板酶重组酶（FLP）基因、温度敏感复制起点和抗生素抗性选择标记的敲除菌株。鉴于产酸杆菌BW21对氨苄青霉素具有天然抗性，我们在质粒pSIIJ8中用四环素抗性基因替换了氨苄青霉素抗性基因，得到质粒pSIJ-8-tet。用质粒pSIJ8-tet转化K.oxytoca BW21。使用质粒pKD4作为模板，使用与靶基因上游和下游区域同源的50至100 bp延伸的引物构建敲入式盒PCR产物。通过电穿孔将扩增的FRT-Kanr-FRT盒引入携带pSIJ8-tet的菌株中，并通过基于λ红的重组在靶染色体位点进行重组。
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参考文献：Tao W, Wang Y, Walters E, Lin H, Li S, Huang H, Kasuga T, Fan Z. Homoethanol Production from Glycerol and Gluconate Using Recombinant Klebsiella oxytoca Strains. Appl Environ Microbiol. 2019 Feb 20;85(5):e02122-18.
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构建含有阿拉伯糖诱导启动子下的λ-红重组基因、鼠李糖诱导启动子下的翻板酶重组酶（FLP）基因、温度敏感复制起点和抗生素抗性选择标记的敲除菌株。鉴于产酸杆菌BW21对氨苄青霉素具有天然抗性，我们在质粒pSIIJ8中用四环素抗性基因替换了氨苄青霉素抗性基因，得到质粒pSIJ-8-tet。用质粒pSIJ8-tet转化K.oxytoca BW21。使用质粒pKD4作为模板，使用与靶基因上游和下游区域同源的50至100 bp延伸的引物构建敲入式盒PCR产物。通过电穿孔将扩增的FRT-Kanr-FRT盒引入携带pSIJ8-tet的菌株中，并通过基于λ红的重组在靶染色体位点进行重组。
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参考文献：Tao W, Wang Y, Walters E, Lin H, Li S, Huang H, Kasuga T, Fan Z. Homoethanol Production from Glycerol and Gluconate Using Recombinant Klebsiella oxytoca Strains. Appl Environ Microbiol. 2019 Feb 20;85(5):e02122-18.
