分别使用引物和双结合引物对pMEL11和pROS11的质粒骨架进行PCR扩增。以pMEL11为模板，使用引物对GND2和ALD6进行PCR，获得表达20bp gRNA靶向序列的质粒插入序列。以pROS11为模板，分别使用双结合引物6965和6966通过PCR获得表达靶向GPD1和GPD2的gRNA序列的插入序列。使用Phusion®Hot Start II高保真DNA聚合酶进行PCR扩增以构建质粒和表达盒。使用Gibson assembly®克隆试剂盒进行质粒预装配。通过产生的PCR片段的5'和3'端的同源序列进行组装。pMEL11骨架的组装和靶向GND1和GND2的gRNA的插入序列分别产生质粒pUDR122和pUDR123。
参考文献：Papapetridis I, van Dijk M, Dobbe AP, Metz B, Pronk JT, van Maris AJ. Improving ethanol yield in acetate-reducing Saccharomyces cerevisiae by cofactor engineering of 6-phosphogluconate dehydrogenase and deletion of ALD6. Microb Cell Fact. 2016 Apr 26;15:67.
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参考文献：Papapetridis I, van Dijk M, Dobbe AP, Metz B, Pronk JT, van Maris AJ. Improving ethanol yield in acetate-reducing Saccharomyces cerevisiae by cofactor engineering of 6-phosphogluconate dehydrogenase and deletion of ALD6. Microb Cell Fact. 2016 Apr 26;15:67.
