以质粒pK18obsacB为模板，通过PCR扩增出含有sacB基因簇的1.85-kb DNA片段。将sacB基因簇的天然启动子转化为棒状杆菌中的一个强促动子tac-M。使用引物pk18msF和pk18msR扩增pK18obsacB除了sacB基因的整个骨架。用SpeI和EcoRV消化这两个片段，并连接在一起形成诱导自杀载体pK-JL（5570 bp）。使用不可复制的整合载体pK-JL对基因进行破坏，该载体允许无标记地删除靶基因。使用引物从谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中扩增argR基因的侧翼序列（1153 bp和921 bp），并分别连接到pMD18-T中。分别使用BamHI/XbaI和XbaI/SalI切除这两个片段，然后连接到pK-JL的BamHI/SalI位点，获得不可复制的整合载体pK-ΔargR，其中argR基因内部缺失506 bp。将上述不可复制的整合载体pK-ΔargR转移到谷氨酸梭菌中，以破坏位点特异性基因。
参考文献：Jiang LY, Chen SG, Zhang YY, Liu JZ. Metabolic evolution of Corynebacterium glutamicum for increased production of L-ornithine. BMC Biotechnol. 2013 Jun 1;13:47.
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以质粒pK18obsacB为模板，通过PCR扩增出含有sacB基因簇的1.85-kb DNA片段。将sacB基因簇的天然启动子转化为棒状杆菌中的一个强促动子tac-M。使用引物pk18msF和pk18msR扩增pK18obsacB除了sacB基因的整个骨架。用SpeI和EcoRV消化这两个片段，并连接在一起形成诱导自杀载体pK-JL（5570 bp）。使用不可复制的整合载体pK-JL对基因进行破坏，该载体允许无标记地删除靶基因。使用引物从谷氨酸棒杆菌的基因组DNA中扩增argR基因的侧翼序列（1153 bp和921 bp），并分别连接到pMD18-T中。分别使用BamHI/XbaI和XbaI/SalI切除这两个片段，然后连接到pK-JL的BamHI/SalI位点，获得不可复制的整合载体pK-ΔargR，其中argR基因内部缺失506 bp。将上述不可复制的整合载体pK-ΔargR转移到谷氨酸梭菌中，以破坏位点特异性基因。
参考文献：Jiang LY, Chen SG, Zhang YY, Liu JZ. Metabolic evolution of Corynebacterium glutamicum for increased production of L-ornithine. BMC Biotechnol. 2013 Jun 1;13:47.
