以pSI103质粒为模板对于两侧有两个直接重复的loxP-aphVIII-T-loxP的aphVIII表达盒的PCR扩增。使用SmaI和XbaI消化扩增的片段，并将其插入pBluescript II SK（+）质粒的SmaI与XbaI位点之间，以构建ploxP-aphVIII质粒。优化了Cre重组酶基因的密码子。以pSI103质粒为模板扩增HSP70-RBCS2启动子序列；以pSI103质粒为模板，扩增出RBCS2终止子序列；以pUCrcre质粒为模板扩增CrCRE序列。使用三个片段作为模板，通过PCR将第一步扩增的三个片段组装成单个片段。使用PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，用SmaI和XbaI消化，并克隆在pBluescript II SK（+）质粒的SmaI与XbaI位点之间。扩增出含有融合到ble的HSP70-RBCS2启动子片段。以pCrcre质粒为模板，扩增出含有融合到RBCS2终止子的CrCRE片段。通过PCR将扩增片段组装成单个片段，形成ble CrCRE表达盒I。使用PCR纯化试剂盒纯化盒DNA，用HindIII和XbaI消化，并克隆在pBluescript II SK（+）质粒的HindIII和XbaI位点之间，以产生pbleCrcre质粒。
参考文献：Kasai Y, Harayama S. Construction of Marker-Free Transgenic Strains of Chlamydomonas reinhardtii Using a Cre/loxP-Mediated Recombinase System. PLoS One. 2016 Aug 26;11(8):e0161733.
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以pSI103质粒为模板对于两侧有两个直接重复的loxP-aphVIII-T-loxP的aphVIII表达盒的PCR扩增。使用SmaI和XbaI消化扩增的片段，并将其插入pBluescript II SK（+）质粒的SmaI与XbaI位点之间，以构建ploxP-aphVIII质粒。优化了Cre重组酶基因的密码子。以pSI103质粒为模板扩增HSP70-RBCS2启动子序列；以pSI103质粒为模板，扩增出RBCS2终止子序列；以pUCrcre质粒为模板扩增CrCRE序列。使用三个片段作为模板，通过PCR将第一步扩增的三个片段组装成单个片段。使用PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，用SmaI和XbaI消化，并克隆在pBluescript II SK（+）质粒的SmaI与XbaI位点之间。扩增出含有融合到ble的HSP70-RBCS2启动子片段。以pCrcre质粒为模板，扩增出含有融合到RBCS2终止子的CrCRE片段。通过PCR将扩增片段组装成单个片段，形成ble CrCRE表达盒I。使用PCR纯化试剂盒纯化盒DNA，用HindIII和XbaI消化，并克隆在pBluescript II SK（+）质粒的HindIII和XbaI位点之间，以产生pbleCrcre质粒。
参考文献：Kasai Y, Harayama S. Construction of Marker-Free Transgenic Strains of Chlamydomonas reinhardtii Using a Cre/loxP-Mediated Recombinase System. PLoS One. 2016 Aug 26;11(8):e0161733.
