为了构建用于扩增lox66-Cmr-lox71盒的模板载体pMSmulox，使用引物P1和P2扩增pMVSCS1的cat基因。在这些引物的5’末端，添加lox66和lox71序列以替换pUG6的lox序列。该盒依次用HindIII和SmaI消化，并与HindIII和EcoRV消化的pUG6连接。为了制备ldhA基因缺失载体，将含有sacB基因的pSacHR06用BamHI和PstI消化。从产琥珀酸分枝杆菌基因组DNA中扩增出左同源区，用BamHI和PstI消化，并与pSacHR06连接以获得pldhAL。该质粒再次用SalI和SphI消化，然后与用引物扩增的正确同源区域连接，获得pldhALR。用引物从pMSmulox扩增lox66-Cmr-lox71盒，并用S1核酸酶处理使其末端变钝。最后，用EcoRV消化pldhALR，用南极磷酸酶处理以防止自连接，并与lox66-Cmr-lox71盒连接以获得pMFldhA。为了制备oadGAB操纵子缺失载体，扩增pEMulox的lox66-Cmr-lox71盒。分别扩增左、右同源区。以这三种PCR产物为模板，进行重叠PCR，获得左同源区-lox66-Cmr-lox71-右同源区盒。用PstI-SalI消化盒和pSacHR06，并连接以获得pMFoad。使用产琥珀酸分枝杆菌表达载体pMS3构建cre基因表达Ts质粒pCRX5。从pMVSCS1-Ts中扩增Ts来源，并用AatII消化。pMS3质粒用AatII消化以去除产琥珀酸分枝杆菌的复制起点，并用Ts起点替换以制备pMS3-Ts。cre基因通过依次用XbaI、T4 DNA聚合酶钝化和HindIII处理从pJW168中分离出来。依次用EcoRI、T4 DNA聚合酶和HindIII处理的质粒pMS3-ts与cre基因连接，构建pCRX5。
参考文献：Kim JM, Lee KH, Lee SY. Development of a markerless gene knock-out system for Mannheimia succiniciproducens using a temperature-sensitive plasmid. FEMS Microbiol Lett. 2008 Jan;278(1):78-85.
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参考文献：Kim JM, Lee KH, Lee SY. Development of a markerless gene knock-out system for Mannheimia succiniciproducens using a temperature-sensitive plasmid. FEMS Microbiol Lett. 2008 Jan;278(1):78-85.
