从质粒pMO5[4中扩增出编码缺乏罗勒信号肽编码区的GES的基因。从黄原毛杆菌基因组DNA中扩增出MVA途径的6个基因，即HMG-CoA合酶（hmgs）、HMG-CoA-还原酶（hmgr）、甲羟戊酸激酶（mvk）、磷酸甲羟戊酸激酶（pmvk）、二磷酸甲羟缬酸脱羧酶（mvd）和异戊烯基二磷酸异构酶（idi）。为了在恶臭假单胞菌DSM 12264中表达基因，使用了质粒pMiS1。使用引物从pMO5中扩增出ges基因，并通过KpnI和SacI克隆到pMiS1中，得到pMiS1-ges。为了将MVA通路基因克隆到pMiS1中，首先使用从黄原毛杆菌基因组DNA中扩增hmgs，并通过BamHI和HindIII克隆到pMiS1中，产生pMiS1-hm gs。然后，将操纵子（包含所有其他基因）依次克隆到pUC18中。使用引物pMiS1-MVA-f1、pMiS1-MVA-r1（第1部分，含有上游Shine-Dalgarno序列）、pMiS1-MVA-f2、pMiS1-2MVA-r2（第2部分）和pMiS1-MWA-f3、pMiS1MVA-r3（第3部分）进行了三次扩增。使用BamHI、SacI和EcoRI作为限制性位点结扎部分。然后通过AvrII和HindIII从得到的pUC18-mva-op中切割出包含所有5个基因的新操纵子，并将其连接到pMiS1-hmgs中，得到pMiS1-mva。然后从pMiS1-ges中切下ges基因，并使用PmeI和BamHI连接到pMiS1-mva中，得到pMiS1-ges-mva。
参考文献：Mi J, Becher D, Lubuta P, Dany S, Tusch K, Schewe H, Buchhaupt M, Schrader J. De novo production of the monoterpenoid geranic acid by metabolically engineered Pseudomonas putida. Microb Cell Fact. 2014 Dec 4;13:170.
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从质粒pMO5[4中扩增出编码缺乏罗勒信号肽编码区的GES的基因。从黄原毛杆菌基因组DNA中扩增出MVA途径的6个基因，即HMG-CoA合酶（hmgs）、HMG-CoA-还原酶（hmgr）、甲羟戊酸激酶（mvk）、磷酸甲羟戊酸激酶（pmvk）、二磷酸甲羟缬酸脱羧酶（mvd）和异戊烯基二磷酸异构酶（idi）。为了在恶臭假单胞菌DSM 12264中表达基因，使用了质粒pMiS1。使用引物从pMO5中扩增出ges基因，并通过KpnI和SacI克隆到pMiS1中，得到pMiS1-ges。为了将MVA通路基因克隆到pMiS1中，首先使用从黄原毛杆菌基因组DNA中扩增hmgs，并通过BamHI和HindIII克隆到pMiS1中，产生pMiS1-hm gs。然后，将操纵子（包含所有其他基因）依次克隆到pUC18中。使用引物pMiS1-MVA-f1、pMiS1-MVA-r1（第1部分，含有上游Shine-Dalgarno序列）、pMiS1-MVA-f2、pMiS1-2MVA-r2（第2部分）和pMiS1-MWA-f3、pMiS1MVA-r3（第3部分）进行了三次扩增。使用BamHI、SacI和EcoRI作为限制性位点结扎部分。然后通过AvrII和HindIII从得到的pUC18-mva-op中切割出包含所有5个基因的新操纵子，并将其连接到pMiS1-hmgs中，得到pMiS1-mva。然后从pMiS1-ges中切下ges基因，并使用PmeI和BamHI连接到pMiS1-mva中，得到pMiS1-ges-mva。
参考文献：Mi J, Becher D, Lubuta P, Dany S, Tusch K, Schewe H, Buchhaupt M, Schrader J. De novo production of the monoterpenoid geranic acid by metabolically engineered Pseudomonas putida. Microb Cell Fact. 2014 Dec 4;13:170.
