用限制性内切酶BglII和BamHI去除质粒pFC332中的Cas9和gRNA表达盒，剩余的骨架自连接形成质粒pSB-HA，其中包含AMA1序列和hph抗性基因。为了将基因的上游和下游同源区域（每个区域约500 bp）oah和Andct分别插入表达载体中，通过PCR从野生型基因组DNA中扩增出两个DNA片段，然后将DNA片段单独克隆到pJET1.2/钝克隆载体中。通过反向PCR将所得含HR的质粒线性化，用于后续克隆步骤。对于黑曲霉中Acdct基因和frd基因的过表达，分别用相应的引物通过PCR从先前构建的质粒pSBe3Dct和pSBe1Frd中扩增Acdct和frd表达盒。然后使用NEB-Gibson组装试剂盒将两个表达盒克隆到相应的含HR的质粒中。
参考文献：Yang L, Henriksen MM, Hansen RS, Lübeck M, Vang J, Andersen JE, Bille S, Lübeck PS. Metabolic engineering of Aspergillus niger via ribonucleoprotein-based CRISPR-Cas9 system for succinic acid production from renewable biomass. Biotechnol Biofuels. 2020 Dec 14;13(1):206.
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用限制性内切酶BglII和BamHI去除质粒pFC332中的Cas9和gRNA表达盒，剩余的骨架自连接形成质粒pSB-HA，其中包含AMA1序列和hph抗性基因。为了将基因的上游和下游同源区域（每个区域约500 bp）oah和Andct分别插入表达载体中，通过PCR从野生型基因组DNA中扩增出两个DNA片段，然后将DNA片段单独克隆到pJET1.2/钝克隆载体中。通过反向PCR将所得含HR的质粒线性化，用于后续克隆步骤。对于黑曲霉中Acdct基因和frd基因的过表达，分别用相应的引物通过PCR从先前构建的质粒pSBe3Dct和pSBe1Frd中扩增Acdct和frd表达盒。然后使用NEB-Gibson组装试剂盒将两个表达盒克隆到相应的含HR的质粒中。
参考文献：Yang L, Henriksen MM, Hansen RS, Lübeck M, Vang J, Andersen JE, Bille S, Lübeck PS. Metabolic engineering of Aspergillus niger via ribonucleoprotein-based CRISPR-Cas9 system for succinic acid production from renewable biomass. Biotechnol Biofuels. 2020 Dec 14;13(1):206.
