使用引物P1和P2通过PCR扩增枯草芽孢杆菌ACR菌株编码NADH氧化酶（yodC）的yodC基因。通过将yodC插入pMD-18T的克隆位点构建T-yodC。扩增来自载体pBGSC6的CAT表达盒（由CAT编码）。对来自Candida boidinii的编码甲酸脱氢酶（fdh）的fdh基因进行PCR扩增。将扩增的fdh基因插入质粒pMA5-HapII的Nde I和Mlu I位点，以创建pMA5-fdh。然后使用引物P7和P8对质粒pMA5-fdh的fdh基因和Hap II启动子进行PCR扩增。然后，将cat和HapII-fdh分别插入T-yodC的Eco47-III位点，构建质粒T-yodC:：cat和T-yodC:HapII-fdh。将质粒T-yodC:：cat和T-yodC：HapII-fdh转化到枯草芽孢杆菌ACR中，分别构建重组菌株AY和AFY。使用引物P9和P10通过PCR扩增编码枯草芽孢杆菌ACR LDH的ldhA基因。通过将yodC插入pMD-18T的克隆位点构建T-ldhA。通过插入cat来破坏ldhA基因，构建质粒T-ldhA:：cat；然后将T-ldhA:：cat转化到枯草芽孢杆菌AFY中，构建重组菌株AFYL。通过PCR确认Cat表达盒和HapII-fdh的插入。质粒首先通过氯化钙法转化到大肠杆菌JM109细胞中，随后从大肠杆菌JM 109中分离出来，然后使用Vojcic等人描述的方法转化为枯草芽孢杆菌。
参考文献：Yang T, Rao Z, Hu G, Zhang X, Liu M, Dai Y, Xu M, Xu Z, Yang ST. Metabolic engineering of Bacillus subtilis for redistributing the carbon flux to 2,3-butanediol by manipulating NADH levels. Biotechnol Biofuels. 2015 Aug 27;8:129.
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参考文献：Yang T, Rao Z, Hu G, Zhang X, Liu M, Dai Y, Xu M, Xu Z, Yang ST. Metabolic engineering of Bacillus subtilis for redistributing the carbon flux to 2,3-butanediol by manipulating NADH levels. Biotechnol Biofuels. 2015 Aug 27;8:129.
