使用2×Phanta Max Master Mix DNA聚合酶分别从枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌MG1655的基因组中扩增出阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE和半乳糖相关基因簇galKTE。pMA5质粒用限制性内切酶BamHI和MIuI消化，并使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒（Vazyme，中国南京）将每个基因连接到载体中。使用Spizizen方法将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中。引物用于扩增缺失片段的上游（约800 bp）（LF）和下游同源臂（约800 bps）（RF）、重复序列DR（约500 bp）和PC cassette（Pbc-pheS*-cat cassette）（约1900 bp）。使用重叠PCR融合LF、DR、PC和RF。使用PCR和测序对敲除菌株进行验证。
参考文献：Li T, Liu P, Guo G, Liu Z, Zhong L, Guo L, Chen C, Hao N, Ouyang P. Production of acetoin and its derivative tetramethylpyrazine from okara hydrolysate with Bacillus subtilis. AMB Express. 2023 Feb 28;13(1):25.
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使用2×Phanta Max Master Mix DNA聚合酶分别从枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌MG1655的基因组中扩增出阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE和半乳糖相关基因簇galKTE。pMA5质粒用限制性内切酶BamHI和MIuI消化，并使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒（Vazyme，中国南京）将每个基因连接到载体中。使用Spizizen方法将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中。引物用于扩增缺失片段的上游（约800 bp）（LF）和下游同源臂（约800 bps）（RF）、重复序列DR（约500 bp）和PC cassette（Pbc-pheS*-cat cassette）（约1900 bp）。使用重叠PCR融合LF、DR、PC和RF。使用PCR和测序对敲除菌株进行验证。
参考文献：Li T, Liu P, Guo G, Liu Z, Zhong L, Guo L, Chen C, Hao N, Ouyang P. Production of acetoin and its derivative tetramethylpyrazine from okara hydrolysate with Bacillus subtilis. AMB Express. 2023 Feb 28;13(1):25.
