分别使用引物从解脂耶氏酵母的基因组DNA中扩增出shd5-up（~1000 bp）和sdh5-down（~1000 bps）的基因片段。从JMP113载体中扩增URA3标记片段。通过PCR扩增产生线性化的pBluescript SK（−）载体骨。将所有四种PCR产物与反应试剂在50°C下混合1小时进行酶组装，然后将反应试剂全部转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。通过菌落PCR提取阳性转化体，得到质粒pPUT。经基因测序验证后，使用引物从pPUT扩增出破坏盒PUT，纯化的PCR产物通过LiAc法转化到菌株Po1f。在YNBG平板上选择URA+转化体。以基因组DNA为模板，通过诊断PCR筛选双同源重组体。获得的敲除突变体被命名为Y.lipolytica PGC01003。
参考文献：Gao C, Yang X, Wang H, Rivero CP, Li C, Cui Z, Qi Q, Lin CSK. Robust succinic acid production from crude glycerol using engineered Yarrowia lipolytica. Biotechnol Biofuels. 2016 Aug 30;9(1):179.
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分别使用引物从解脂耶氏酵母的基因组DNA中扩增出shd5-up（~1000 bp）和sdh5-down（~1000 bps）的基因片段。从JMP113载体中扩增URA3标记片段。通过PCR扩增产生线性化的pBluescript SK（−）载体骨。将所有四种PCR产物与反应试剂在50°C下混合1小时进行酶组装，然后将反应试剂全部转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。通过菌落PCR提取阳性转化体，得到质粒pPUT。经基因测序验证后，使用引物从pPUT扩增出破坏盒PUT，纯化的PCR产物通过LiAc法转化到菌株Po1f。在YNBG平板上选择URA+转化体。以基因组DNA为模板，通过诊断PCR筛选双同源重组体。获得的敲除突变体被命名为Y.lipolytica PGC01003。
参考文献：Gao C, Yang X, Wang H, Rivero CP, Li C, Cui Z, Qi Q, Lin CSK. Robust succinic acid production from crude glycerol using engineered Yarrowia lipolytica. Biotechnol Biofuels. 2016 Aug 30;9(1):179.
