从甲醇芽孢杆菌基因组DNA中PCR扩增出prs、guaAB或tkt和rpe基因。使用CloneAmp HiFi PCR预混物（Takara）扩增PCR产物，并使用Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。通过等温DNA组装，将PCR扩增的rib操纵子与消化的pBV2xp（用SacI和BamHI切割）连接，并将PCR扩增基因prs、guaAB或tkt和rpe引入消化的pTH1mp载体（用XbaI和BamHI剪切）。结果，创建了质粒pBV2xp-ribBl、pBV2xp-ribBm、pBV2xp-ribBs、pTH1mp-rpe-tkt和pTH1mp-prs-guaAB。载体pUB110Sxp是分多步构建的。首先，用XbaI和PstI消化pUB110Smp以去除mdh启动子。然后插入木糖诱导型启动子来交换启动子，该启动子之前使用引物XP1和XP2从pBV2xp质粒中PCR扩增。使用相同的DNA组装方法将消化的pUB110Sxp质粒（用SacI和BamHI切割）和来源于地衣芽孢杆菌的肋骨操纵子连接起来，形成质粒pUB110Skp-ribBl。为了创建质粒pUB110Sxp-ribBs，用限制性内切酶PstI和NdeI切割空载体pUB100Smp，以去除mdh启动子，然后将空载体与pBV2xp-ribBs质粒的PCR扩增片段组装在一起，该片段包含木糖诱导型启动子及其调节因子。所有等温DNA组装后，热休克转化进大肠杆菌DH5α。
参考文献：Klein VJ, Brito LF, Perez-Garcia F, Brautaset T, Irla M. Metabolic engineering of thermophilic Bacillus methanolicus for riboflavin overproduction from methanol. Microb Biotechnol. 2023 May;16(5):1011-1026.
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参考文献：Klein VJ, Brito LF, Perez-Garcia F, Brautaset T, Irla M. Metabolic engineering of thermophilic Bacillus methanolicus for riboflavin overproduction from methanol. Microb Biotechnol. 2023 May;16(5):1011-1026.
