对于基因过表达AgGPD，AgGPD基因的启动子序列整合在每个基因的ATG启动子密码子的上游。使用每个基因的特异性引物对包含AgGPD启动子（P）和loxP-KanMX-loxP选择性标记的过表达盒进行PCR扩增，该标记赋予对遗传霉素的抗性（G418）。利用过表达模块转化棉蚜孢子，在含G418的培养基中筛选阳性克隆。通过初生转枝孢的产孢获得同核克隆。通过分析PCR和DNA测序确认每个过表达盒的正确基因组整合。通过qRT-PCR分析检查基因过表达。对于AgADE12的缺失，通过loxP-KanMX-loxP标记的PCR扩增构建了ADE12基因的基因替换盒。替换盒用于转化棉蚜孢子。在含G418的培养基中选择初级转化体，并通过初级转化体的产孢分离同核克隆。通过分析PCR和DNA测序证实了替换盒的同源整合。核黄素采用分光光度法测定。
参考文献：Ledesma-Amaro R, Serrano-Amatriain C, Jiménez A, Revuelta JL. Metabolic engineering of riboflavin production in Ashbya gossypii through pathway optimization. Microb Cell Fact. 2015 Oct 14;14:163.
技术服务 Technology Services
联系我们
CONTACT US
-
0574-87917803
服务热线 -
testobio@163.com
邮箱
对于基因过表达AgGPD，AgGPD基因的启动子序列整合在每个基因的ATG启动子密码子的上游。使用每个基因的特异性引物对包含AgGPD启动子（P）和loxP-KanMX-loxP选择性标记的过表达盒进行PCR扩增，该标记赋予对遗传霉素的抗性（G418）。利用过表达模块转化棉蚜孢子，在含G418的培养基中筛选阳性克隆。通过初生转枝孢的产孢获得同核克隆。通过分析PCR和DNA测序确认每个过表达盒的正确基因组整合。通过qRT-PCR分析检查基因过表达。对于AgADE12的缺失，通过loxP-KanMX-loxP标记的PCR扩增构建了ADE12基因的基因替换盒。替换盒用于转化棉蚜孢子。在含G418的培养基中选择初级转化体，并通过初级转化体的产孢分离同核克隆。通过分析PCR和DNA测序证实了替换盒的同源整合。核黄素采用分光光度法测定。
参考文献：Ledesma-Amaro R, Serrano-Amatriain C, Jiménez A, Revuelta JL. Metabolic engineering of riboflavin production in Ashbya gossypii through pathway optimization. Microb Cell Fact. 2015 Oct 14;14:163.
