为了删除prpC和prpE，使用Gibson组装克隆法构建pQSAK质粒，每个基因的上游和下游同源区约为500 bp。然后将质粒构建体转化到恶臭假单胞菌EM42中。经过双重同源重组后，从蔗糖卡那霉素平板上挑选菌落，使用SacB进行阴性选择。通过PCR和DNA测序证实了缺失。在之前的一项研究中，使用来自恶臭假单胞菌KT2440的lva操纵子的转录激活剂LvaR及其同源lvaA启动子开发了LA诱导表达系统。随后，构建了质粒pPROBE_LvaR/PlvaA_egfp+，并通过表达绿色荧光蛋白作为报告蛋白来分析基于LA的诱导。为了构建pPROBE_LuaR/PlvaA_yciA和pPROBE.LuaR/Plva A_ygfH质粒，使用补充表S1中描述的引物分别从流感嗜血杆菌和大肠杆菌中扩增出yciA基因和ygfH基因。然后通过用NdeI/HindIII消化pPROBE_LvaR/PlvaA_egfp+并使用Gibson组装克隆方法用每个基因替换egfp+来克隆扩增的基因产物。通过RBS序列分离的两个基因的转录融合构建了pPROBE_LvaR/PlvaA_yciA_ygfH质粒。然后将构建的质粒转化到EM42:ΔCE菌株中，得到EM42:△CE:yciA、EM42:＜CE:ygfH和EM42:＞CE:yciA:ygfH菌株。
参考文献：Tiwari R, Sathesh-Prabu C, Lee SK. Bioproduction of propionic acid using levulinic acid by engineered Pseudomonas putida. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Aug 10;10:939248.
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参考文献：Tiwari R, Sathesh-Prabu C, Lee SK. Bioproduction of propionic acid using levulinic acid by engineered Pseudomonas putida. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Aug 10;10:939248.
