将具有优化核糖体结合位点的alkB、alkG和alkT基因克隆到pTrc99a中，形成的质粒命名为pBGT。使用基于CRISPR-Cas9和λRed重组系统的基因组编辑系统构建了具有fadD和fadE缺失的菌株，该系统由五个元件组成：Cas9表达盒、gRNA表达质粒、λRed重组、供体模板DNA和用于从细胞中消除gRNA质粒的诱导性质粒固化系统。为了构建gRNA表达质粒，使用一对包含靶基因特异性20bp间隔序列的引物通过PCR扩增pGRB骨架。然后通过同源重组连接PCR产物以获得所需的gRNA表达质粒。为了构建供体dsDNA，通过PCR分别扩增靶基因的上游和下游序列，即300-500bp的同源序列，然后通过重叠PCR融合在一起。构建后用基因组PCR验证突变株，以确保靶基因已被删除。为了构建AlkBGT和FadL表达质粒，采用了一步克隆法。通过PCR扩增恶臭假单胞菌GPo1的alkB、alkG、alkT基因片段。将具有优化核糖体结合位点的alkB、alkG和alkT基因克隆到pTrc99a中，形成的质粒命名为pBGT。在pBGT中alkT后面进一步添加天然fadL，优化核糖体结合位点，新形成的质粒命名为pBGT-fadL。
参考文献：He Q, Bennett GN, San KY, Wu H. Biosynthesis of Medium-Chain ω-Hydroxy Fatty Acids by AlkBGT of Pseudomonas putida GPo1 With Native FadL in Engineered Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 2019 Oct 17;7:273.
技术服务 Technology Services
联系我们
CONTACT US
-
0574-87917803
服务热线 -
testobio@163.com
邮箱
将具有优化核糖体结合位点的alkB、alkG和alkT基因克隆到pTrc99a中，形成的质粒命名为pBGT。使用基于CRISPR-Cas9和λRed重组系统的基因组编辑系统构建了具有fadD和fadE缺失的菌株，该系统由五个元件组成：Cas9表达盒、gRNA表达质粒、λRed重组、供体模板DNA和用于从细胞中消除gRNA质粒的诱导性质粒固化系统。为了构建gRNA表达质粒，使用一对包含靶基因特异性20bp间隔序列的引物通过PCR扩增pGRB骨架。然后通过同源重组连接PCR产物以获得所需的gRNA表达质粒。为了构建供体dsDNA，通过PCR分别扩增靶基因的上游和下游序列，即300-500bp的同源序列，然后通过重叠PCR融合在一起。构建后用基因组PCR验证突变株，以确保靶基因已被删除。为了构建AlkBGT和FadL表达质粒，采用了一步克隆法。通过PCR扩增恶臭假单胞菌GPo1的alkB、alkG、alkT基因片段。将具有优化核糖体结合位点的alkB、alkG和alkT基因克隆到pTrc99a中，形成的质粒命名为pBGT。在pBGT中alkT后面进一步添加天然fadL，优化核糖体结合位点，新形成的质粒命名为pBGT-fadL。
参考文献：He Q, Bennett GN, San KY, Wu H. Biosynthesis of Medium-Chain ω-Hydroxy Fatty Acids by AlkBGT of Pseudomonas putida GPo1 With Native FadL in Engineered Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 2019 Oct 17;7:273.
