敲除：
1. PCR扩增位于RadD基因侧翼的两个同源臂。将这两个DNA片段融合，
2. 克隆到整合载体pFJ-KO（含有氯霉素乙酰转移酶基因（catP）和galK基因）中。
3. 通过电穿孔将得到的质粒引入有核梭杆菌，并在厌氧条件下，在含有5μg/ml甲砜霉素的TSPC琼脂平板上筛选发生了一次重组的中间体。
4. 将中间体放在含有0.5%2-DG的TSPC板上筛选进行了二次重组敲除了RadD基因的菌株。
回补：
1. 使用引物从具核梭杆菌ATCC25586的基因组DNA中PCR扩增出启动子PFn1529，使用引物从具核梭杆菌ATCC23726的gDNA中扩增出radD基因的1-4450bp区域。通过重叠PCR连接这两个DNA片段并添加BamHI和PstI位点。
2. 使用引物对剩余的radD基因区域和下游的约1kbDNA片段进行PCR扩增并添加PstI和XhoI位点。
3. 将产生的PCR产物分别用BamHI和PstI和PstI和XhoI限制性内切酶消化，然后连接到线性pUC19-catP载体中，得到质粒pFJ-PFn1529-radD。
4. 通过电穿孔将得到的质粒pFJ-PFn1529-radD引入FnΔrad。通过同源重组将质粒插入细菌染色体，筛选在厌氧条件下于37°C下在含有5μg/ml甲砜霉素的TSPC琼脂平板上存活的菌株。
参考文献：Zhang L, Leng XX, Qi J, Wang N, Han JX, Tao ZH, Zhuang ZY, Ren Y, Xie YL, Jiang SS, Li JL, Chen H, Zhou CB, Cui Y, Chen X, Wang Z, Zhang ZZ, Hong J, Chen HY, Jiang W, Chen YX, Zhao X, Yu J, Fang JY. The adhesin RadD enhances Fusobacterium nucleatum tumour colonization and colorectal carcinogenesis. Nat Microbiol. 2024 Sep;9(9):2292-2307. doi: 10.1038/s41564-024-01784-w. Epub 2024 Aug 21. PMID: 39169124.
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2. 克隆到整合载体pFJ-KO（含有氯霉素乙酰转移酶基因（catP）和galK基因）中。
3. 通过电穿孔将得到的质粒引入有核梭杆菌，并在厌氧条件下，在含有5μg/ml甲砜霉素的TSPC琼脂平板上筛选发生了一次重组的中间体。
4. 将中间体放在含有0.5%2-DG的TSPC板上筛选进行了二次重组敲除了RadD基因的菌株。
回补：
1. 使用引物从具核梭杆菌ATCC25586的基因组DNA中PCR扩增出启动子PFn1529，使用引物从具核梭杆菌ATCC23726的gDNA中扩增出radD基因的1-4450bp区域。通过重叠PCR连接这两个DNA片段并添加BamHI和PstI位点。
2. 使用引物对剩余的radD基因区域和下游的约1kbDNA片段进行PCR扩增并添加PstI和XhoI位点。
3. 将产生的PCR产物分别用BamHI和PstI和PstI和XhoI限制性内切酶消化，然后连接到线性pUC19-catP载体中，得到质粒pFJ-PFn1529-radD。
4. 通过电穿孔将得到的质粒pFJ-PFn1529-radD引入FnΔrad。通过同源重组将质粒插入细菌染色体，筛选在厌氧条件下于37°C下在含有5μg/ml甲砜霉素的TSPC琼脂平板上存活的菌株。
参考文献：Zhang L, Leng XX, Qi J, Wang N, Han JX, Tao ZH, Zhuang ZY, Ren Y, Xie YL, Jiang SS, Li JL, Chen H, Zhou CB, Cui Y, Chen X, Wang Z, Zhang ZZ, Hong J, Chen HY, Jiang W, Chen YX, Zhao X, Yu J, Fang JY. The adhesin RadD enhances Fusobacterium nucleatum tumour colonization and colorectal carcinogenesis. Nat Microbiol. 2024 Sep;9(9):2292-2307. doi: 10.1038/s41564-024-01784-w. Epub 2024 Aug 21. PMID: 39169124.
