1.从pUC19中扩增出片段1，包含氨苄青霉素抗性基因（bla）和复制区（pBR322-ori），两侧与片段2有相应的同源性。同时，从质粒pMA09中扩增出片段2，片段2携带复制蛋白（Rep）、卡那霉素抗性基因（neor）和博莱霉素抗性基因（ble），片段2两侧有片段1的相应同源性。1:2的摩尔比混合，然后用T4 DNA聚合酶处理处理2.5分钟，接着将混合物在冰上孵育10分钟，使两个碎片退火，然后将混合物转化进大肠杆菌JM109感受态细胞。将得到的质粒命名为pBSG01。

2.使用引物从B.sub-tilis 168的染色体上扩增出0.6-kb的PsrfA，其两侧在pBSG01插入位置的上游和下游有30 bp的同源序列。然后使用引物反向PCR将质粒pBSG01线性化。将两个碎片连接起来，所得质粒命名为pBSG02。

3.从pBS1154扩增GFP基因，侧翼包含与插入位置的上游和下游序列相对应的30 bp同源序列。同时，用引物通过反向PCR将pBSG02线性化。将这两个片段进行连接，产生质粒pBSG03。以pBSG03为模板，通过反向PCR，用引物构建了携带工程化PsrfA的质粒pBSG05。

4.以质粒pMA05为模板，用引物扩增AP，用引物线性化pBSG02。通过以与pBSG02相同的方式处理这两个片段获得了pBSG06。所有质粒构建体都通过DNA测序进行了验证。

如前所述，对枯草芽孢杆菌168染色体上的基因进行了无标记缺失，并进行了一些修改。

5.从枯草芽孢菌基因组中扩增出两个片段。具体流程如下。用引物扩增了由PsrfA上游约1kb同源片段、枯草芽孢杆菌dif位点和zeo基因5′端6-bp同源区组成的向上序列。同样，用引物扩增了下行序列，该序列由zeo基因3′端的5-bp同源片段，枯草芽孢杆菌dif位点和PsrfA基因下游的约1kb同源片段组成。接下来，使用引物从质粒p7Z6中扩增出抗性基因zeo，其侧翼含有与染色体同源的5-bp序列，5'末端存在着两侧有5-bp染色体同源序列的dif序列。这三个片段通过融合PCR组装。然后对得到的2.5kb片段进行测序，并将其转化到枯草芽孢杆菌168感受态细胞中。PsrfA缺失的阳性突变株命名为BSG1681（枯草芽孢杆菌168:ΔPsrfA）。

参考文献：Guan C, Cui W, Cheng J, Zhou L, Guo J, Hu X, Xiao G, Zhou Z. Construction and development of an auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2015 Sep 21;14:150. doi: 10.1186/s12934-015-0341-2. PMID: 26392346; PMCID: PMC4578258.