大肠杆菌新抗原传统载体编辑

对大肠杆菌1917进行了四个方向的改造

1. 删除了大肠杆菌1917中的隐型质粒

通过cas9介导的双链断裂删除EcN隐型质粒。用pFREE或pCryptDel4.8转化EcN，分别删除隐型质粒pMUT1和pMUT2。

2. 删除了Lon 和 OmpT 蛋白酶

通过PCR扩增pKD3，制备了含靶基因相应悬挂的氯霉素抗性盒。通过红色重组系统删去靶基因，然后通过转化pCP20删去抗性基因

3. 插入了编码源自李斯特菌的 pH 依赖性成孔蛋白的 LLO基因

通过在hok/sok稳定系统中，以pCG02-p15a为模板，PCR扩增克隆出含SLC的骨架，与在组成型启动子和含有选定核糖体结合位点的5′UTR控制下的LLO基因进行Gibson组装，构建了编码组成型LLO的质粒。

4. 构建了一种适应多种新抗原的产生和向淋巴组织和肿瘤微环境 (TME) 递送的微生物系统

新质粒系统含编码组成型启动子和含有选定核糖体结合位点的5′非翻译区（UTR），随后是编码区，由包含突变残基的长肽组成，这些长肽串联或通过各种连接子连接，并用针对大肠杆菌进行密码子优化，将系统克隆到稳定的p246-luxCDABE质粒BamHI和XbaI限制性位点之间，并终止密码子之前添加6×-组氨酸标签（HisTag）的密码子序列。

参考文献：Redenti A, Im J, Redenti B, Li F, Rouanne M, Sheng Z, Sun W, Gurbatri CR, Huang S, Komaranchath M, Jang Y, Hahn J, Ballister ER, Vincent RL, Vardoshivilli A, Danino T, Arpaia N. Probiotic neoantigen delivery vectors for precision cancer immunotherapy. Nature. 2024 Nov;635(8038):453-461.

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