用ClaI对pUL5000进行切割获得含有gehC的片段并克隆到pBluescriptKS（+）中，形成pUL5010。用TaqI从pE194中切除出红霉素耐药基因盒（ermC）然后插入pUL5010的HinlI位点，形成pUL5011。为了使质粒在葡萄球菌中复制，将pCW59的HindIII标记的片段连接到pUL5011的EcoRI位点，构建了穿梭载体pUL5012。为了筛选成功转化的菌株，将含有被破坏的脂肪酶基因的穿梭载体pUL5012和一个不相容的质粒pTS01共转化到表皮葡萄球菌中。
gehD的失活原理与gehC相同，通过将含有ermC盒的pE194的SalI-XhoI片段插入到pUL5041的SalI位点，形成pUL5046。然后将合成的载体pUL5046连接到pCW59的HindIII片段上，得到穿梭载体pUL5047。
参考文献：Longshaw CM, Farrell AM, Wright JD, Holland KT. Identification of a second lipase gene, gehD, in Staphylococcus epidermidis: comparison of sequence with those of other staphylococcal lipases. Microbiology (Reading). 2000 Jun;146 ( Pt 6):1419-1427.
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用ClaI对pUL5000进行切割获得含有gehC的片段并克隆到pBluescriptKS（+）中，形成pUL5010。用TaqI从pE194中切除出红霉素耐药基因盒（ermC）然后插入pUL5010的HinlI位点，形成pUL5011。为了使质粒在葡萄球菌中复制，将pCW59的HindIII标记的片段连接到pUL5011的EcoRI位点，构建了穿梭载体pUL5012。为了筛选成功转化的菌株，将含有被破坏的脂肪酶基因的穿梭载体pUL5012和一个不相容的质粒pTS01共转化到表皮葡萄球菌中。
gehD的失活原理与gehC相同，通过将含有ermC盒的pE194的SalI-XhoI片段插入到pUL5041的SalI位点，形成pUL5046。然后将合成的载体pUL5046连接到pCW59的HindIII片段上，得到穿梭载体pUL5047。
参考文献：Longshaw CM, Farrell AM, Wright JD, Holland KT. Identification of a second lipase gene, gehD, in Staphylococcus epidermidis: comparison of sequence with those of other staphylococcal lipases. Microbiology (Reading). 2000 Jun;146 ( Pt 6):1419-1427.
