核心思路：将SSB蛋白和sgRNA和Cas9蛋白构成的核糖核蛋白复合物直接转化入细胞进行基因编辑。
基础信息：
SSB:DNA单链结合蛋白，用于替代λ-Red重组系统
Cas9：基因编辑高活性蛋白
ssODN：单链寡核苷酸
tetR-dsODN：含四环素耐药基因的双联寡核苷酸，与ssODN一致作为HDR修复机制的供体模板。
Lipofectamine 3000：转染试剂
测试实验：删除大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌的upp基因
1. gRNA
构建了在大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌中针对upp基因的sgRNAs的转录模板。分别用引物对扩增sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的DNA模板，每个引物对作为自己的模板。使用T7转录试剂盒对sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3进行转录。
2. 供体RNA
由BGI合成不含四环素抗性基因的ssODN供体和含有四环素耐药基因的tetR-dsODN供体。
3. 将 sgRNA与Cas9在37℃下孵育20分钟，制备RNP复合物。接下来，将 SSB溶液加入RNP复合材料中，在37℃孵育30分钟，得到RNP+SSB复合物。将RNP复合物和RNP+SSB复合物分别与 Lipofectamine 3000混合，在室温下静置20分钟，分别形成RNP转化系统和RNP+SSB非同源重组转化系统。RNP转换系统作为控制。为了形成同源重组转化系统，将RNP+SSB复合物加入同源片段（ssODN供体或tetR-dsODN供体）中，然后加入Lipofectamine 3000，在室温下混合20分钟。
4. 将转化系统共转化到大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌原生质体中敲除upp基因
参考文献：Chai R, Sun W, Xu Z, Yao X, Chen S, Wang H, Guo J, Zhang Q, Yang Y, Li T, Chen S, Qiu L. Gene editing by SSB/CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein in bacteria. Int J Biol Macromol. 2024 Oct;278(Pt 4):135065.
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核心思路：将SSB蛋白和sgRNA和Cas9蛋白构成的核糖核蛋白复合物直接转化入细胞进行基因编辑。
基础信息：
SSB:DNA单链结合蛋白，用于替代λ-Red重组系统
Cas9：基因编辑高活性蛋白
ssODN：单链寡核苷酸
tetR-dsODN：含四环素耐药基因的双联寡核苷酸，与ssODN一致作为HDR修复机制的供体模板。
Lipofectamine 3000：转染试剂
测试实验：删除大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌的upp基因
1. gRNA
构建了在大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌中针对upp基因的sgRNAs的转录模板。分别用引物对扩增sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的DNA模板，每个引物对作为自己的模板。使用T7转录试剂盒对sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3进行转录。
2. 供体RNA
由BGI合成不含四环素抗性基因的ssODN供体和含有四环素耐药基因的tetR-dsODN供体。
3. 将 sgRNA与Cas9在37℃下孵育20分钟，制备RNP复合物。接下来，将 SSB溶液加入RNP复合材料中，在37℃孵育30分钟，得到RNP+SSB复合物。将RNP复合物和RNP+SSB复合物分别与 Lipofectamine 3000混合，在室温下静置20分钟，分别形成RNP转化系统和RNP+SSB非同源重组转化系统。RNP转换系统作为控制。为了形成同源重组转化系统，将RNP+SSB复合物加入同源片段（ssODN供体或tetR-dsODN供体）中，然后加入Lipofectamine 3000，在室温下混合20分钟。
4. 将转化系统共转化到大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌原生质体中敲除upp基因
参考文献：Chai R, Sun W, Xu Z, Yao X, Chen S, Wang H, Guo J, Zhang Q, Yang Y, Li T, Chen S, Qiu L. Gene editing by SSB/CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein in bacteria. Int J Biol Macromol. 2024 Oct;278(Pt 4):135065.
