1.菌株

Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJ2410）

AHL高效检测菌株，To2 uM/mL，Spe100，Gm100，28℃

2．保存 Prcinduced cell （简称 pre)

2.1 接种KYCS5 至LB中活化，加入相应抗生素。

2.2 长出后，1%转按至 AT medium 中，28°C培养，长至OD600约0.6 左右。

2.3 10000rpm x 10min 离心，去除上清。以“AT/甘油=20”的量加入 20%甘油(即浓缩20倍），分装至1.5ml 离心管中，-20℃保存。

3.制备待检测菌上清

3.1 培养待测菌至 OD600 1.5 左右，12000rpm x 2min 离心保存上清。多余上清或暂吋来不及做 assay 的上清可以保仔在-20℃。

4. Bioassav

4.1 菌液培养

准备无菌空三角瓶，按每株待检测前 1.5ml（包括阴性和阳性对照）计算所需 AT medium 的量，加入其中。

加入千分之一KYC55 Pre 全三角瓶中，和AT 混合均匀后，1.5ml 每管分装到无菌试管中。

标记试管，在每管中分别加入 150ul 待测上清液。同时用阳性菌株上清和培养基分别作为阳性和阴性对照。28℃摇床培养过夜。

4.2 bioassay

培养至 0D600 0.6左右时，取出进行生物显影。

在2ml 离心管中，分别顺序加入：

0.8 ml    Z-buffer

2滴     0.05% SDS

3滴      氯仿

0.2mll    菌液

盖上盖子用力振荡后，再加入 100ul ONPG。再用力振荡，并开始计时。

观察菌液颜色，有明显变黄后，加入 0.6ml IM NaCO;终止反应，并记录时

间。若始终没有变黄，则2h后终止反应。将离心管离心 12000rpm X 2min,OD420。以试管中残留菌体测 OD600。

5. 数据处理：

公式：Miller Units = 1000*OD420/ [OD600* (T_S-T_O)*V_菌液]

其中：Time 以min 为单位

Volumn 为反应时所加的菌液量 (0.2ml)

1. AT培养基

---20 x AT salts: (NH4)2S04 40g     MgS04 1.56g

FeS04•7H20 0.1g   MnS04•H2O 0.044g
以dH20定容至 1000 ml

---20 x AT buffer: KH2P04 214g pH7.3；

以dH20定容至 1000 mL

---50% Glucose

---各组分单独灭菌，50% Glucose 过滤除菌或 115℃灭菌。

---配置 AT培养基（1000mL）时，分别将 50 ml 20 x AT salts 、50 mL 20 x AT buffer、10 mL 50% Glucose 和890mL无菌水在灭过菌的空试剂瓶中混合。

同时加入培养 JZA1 的抗生素，既免去后期培养的麻烦，也可以防止染菌。

2. Z-buffer

Na₂HPO₄.7H₂0  16.1g    NaH₂PO₄H₂0  5.5g    KC1  0.75g

MgSO₄.7H₂0   0.245g   β-巯基乙醇  2.7ml    保存在4℃。

3. 0-Nitrophenyl   β-D-Galactopyranoside (ONPG) （Sigma 公司）

4mg/ml，分装后-20℃保存，只留一管放4℃使用。