质粒DNA的小量制备
⑴将2ml含Amp抗生素的LB培养基加入到容量为10ml并通气良好的大试管中，然后接入一单菌落，37℃剧烈振摇，培养过夜；
⑵将1.5ml培养物倒入eppendorf管中，用微量离心机与4℃，12，000g离心30sec，将剩余培养物贮存于4℃；
⑶倒出培养液，尽可能清除残余液；
⑷将细菌沉淀重悬于100ul冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使细菌沉淀再溶液Ⅰ中完全分散。
溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/Ltris－Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)
⑸加入200ul新配置的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混匀内容物，将离心管放置于冰上3～5min，此时内容物应呈透明状；
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1％SDS
⑹加入150ul冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10sec，混匀内容物，然后将管倒置冰上3～5min；
溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸钾，冰乙酸，水，溶液对钾为3 mol/L，对乙酸为5 mol/L
⑺用微量离心机于4℃，12，000g，离心5min，转移上清至另一离心管中；
⑻加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀；
⑼4℃，12，000g，离心2min，将上清转移到另一离心管中；
⑽加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于室温沉淀双链DNA；
⑾用微量离心机于4℃，12，000g，离心5min；
⑿小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽；
⒀用1ml 70％的乙醇于4℃洗涤DNA沉淀；
⒁冷冻抽干或风干DNA，将其溶于20ulTE缓冲液或无菌双蒸水中，稍事离心后贮存于－20℃备用。

我们实验室的方法：没有用酚/氯仿，一直这么做的，难道？唉，不知道这个方法大家觉得可行不？

a 挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。取培养的菌液1.5 ml于1.5 ml的灭菌小离心管中，12000 rpm离心1 min，去尽上清。

b. 加入150 μl溶液I，用旋涡震荡器充分悬浮菌体。

c. 加入150 μl溶液II，温和摇匀，室温放置2 min。

d. 加入150 μl预冷的溶液III，温和摇匀，-20℃冰箱放置5 min。

e. 10000 rpm，离心10 min，轻轻移取上清至另1个新的1.5 ml灭菌离心管。

f. 加入60%上清体积的异丙醇（不小于60%），混匀，12000 rpm离心5 min。

g. 移取上清至另一灭菌微量离心管中，加0.5 ml 75%酒精洗涤沉淀，静置2 min，10000 rpm离心1 min，倒掉酒精，风干10 min。

h. 加入20 μl 1× TE（含5 μg/ml RNase）溶解DNA，37℃放置1 h，4℃保存备用。

所获得的质粒DNA用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定。经鉴定好的阳性克隆加入1/10体积的80%的无菌甘油，混匀后，放在－80°C冰箱保存。

要正确分析质粒抽提过程中的问题，我建议应该首先了解碱裂解法的原理。下面的转贴可能很多战友都看过了，希望不要拍砖哦。

“【转贴】质粒提取的原理

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概且蛭?斗肿涌寺　防锩嬷唤彩笛椴僮鞑街瑁??挥卸栽?斫?邢晗傅穆凼觥Ｕ馐堑贾挛业难??笕肫缤镜闹饕??颉：罄次曳⑾制涫凳钦?鲋泄?南喙亓煊虻难芯可??蕉疾畈欢啵?踔劣泻芏唷袄鲜Α币彩钦飧鲎刺?Ｕ饩筒坏貌蝗萌烁械奖?Я恕?

我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。 每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。

每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。

想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。留下一个思考题，为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提？”

如果使用试剂盒提取质粒，最好注意下面几个细节。

1，新鲜菌液。-20冻存的菌体沉淀提取质粒的质量不如来自新鲜菌液的，但是对于酶反应和测序等也足够了。

2，不要处理过多的菌液。大致因为两点。一是试剂盒大多采用硅胶膜作为DNA结合介质，少数采用树脂的例如QIAGEN的miniprep试剂盒。这些试剂盒，无论硅胶膜还是树脂，结合DNA的能力都是有限的，所以能够处理的菌液也相对有限。二是试剂盒的溶液I，II，III的加入量有限，能够处理的菌体也有限。如果菌体过多，处理不够充分，质粒提取效果自然不佳。一般1.5ml菌液所获得质粒量就足够了，即使是低拷贝质粒。一般高拷贝质粒4.5ml菌液能获得10－20ug的质粒，这几乎已经是硅胶膜结合DNA能力的极限了。

3，溶液II和溶液III处理的时候动作不要剧烈。特别是溶液III动作过于剧烈，容易导致离心蛋白的效果不佳，也容易导致质粒终产物中的菌体基因组DNA污染的增大。

4，加入漂洗液时，可以静置一下再离心，如果400ulX2两次漂洗效果可能会更好。但是按试剂盒操作说明只700ul一次漂洗所获得的质粒质量也是没有问题的。

5，采用硅胶膜类试剂盒时，一定要在漂洗后再次离心1－3min，以彻底去除漂洗液。漂洗液中含有乙醇，残留在硅胶膜上会导致质粒洗脱效率下降，也会造成质粒后续操作例如酶切效率的降低。

6，离心洗脱前最好静置1－2min。如果有时间也可以将50ulX2两次洗脱，但实际上一次洗脱的效率足够让你获得足量的质粒DNA。

7，采用试剂盒提取的质粒DNA应该基本上只有一条超螺旋，其他带条都是很模糊的，如果其他带条的量比较多，你就要考虑你提取过程中的操作问题了。

“首先是不是提质粒的前一天要要好菌，新鲜菌液要好吧。”
新鲜的菌液比较好,隔夜菌也没问题；

“你们提质粒的步骤都是按分子克隆上的步骤吧，酚氯仿抽提完之后还用氯仿抽提一次吗？”
其实完全可以省掉。

“加完裂解液2，3之后动作不能太大是吧，”
没错。

“提质粒大都提的有三条带，是不是一条带就是好的呢？”
一般是三条，不可能只有一条

“还有就是离菌液的时候老是担心加的少了，可是加多了提出来的质粒会不会不纯呢，有时候这样做酶切时在载体下面会有一条弱的带是不是没有被酶切开的？”
菌液多一点不怕。