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2022-08-01 08:20:46       huishouzhan

1.复制起点:控制着质粒的复制,并决定了质粒的宿主和拷贝数

2.筛选标记:多为抗性基因,以便加以检测筛选

3.多克隆位点:外源基因的插入位点

4.其他元件:如转录调控元件、翻译表达元件和蛋白标签等


以下就用大家常用的pcDNA3.1(+)表达载体作为案例


第一步:了解质粒图谱中的复制起点

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如上图谱中的ori表示质粒的复制起点。质粒的复制起点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数相关。若图谱上只有一个ori,表示质粒是原核克隆及表达质粒。而图谱上有两个ori,则表示该质粒是穿梭质粒,既可以在原核也可以在真核中复制。


第二步:了解质粒图谱中的筛选标记

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图谱中的AmpR、KanR等表示质粒载体中的筛选标签,多为抗生素抗性基因,方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。只存在单抗性的质粒多为原核克隆载体和原核表达载体。而存在两种或以上的抗性的多为穿梭质粒


第三步:了解质粒图谱中的多克隆位点

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图谱中的MCS区或者许多内切酶集中的部分,就是质粒的多克隆位点。多克隆位点为一系列限制性内切酶酶切位点,是外源DNA的插入位点,一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒。多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。


第四步:了解质粒图谱中其它元件

质粒载体中除复制起始位点、筛选标记、多克隆位点外,还具有其他一些表达或调控元件,如转录调控元件、翻译调控元件和融合表达标签蛋白等。比如:

蛋白纯化标签蛋白:His-Tag,GST-tag等

蛋白检测标签蛋白:Myc-Tag,Flag-Tag,HA-Taq等

荧光蛋白表达标签:GFP,mCherry等

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