巴斯德毕赤酵母AOX1启动子来驱动由酿酒酵母CYC1终止子终止的酿酒酵母FLP重组酶的调节表达。从pPpT2扩增出ZeocinTM抗性盒。上述部分在两侧被直接放置的相同的34bp FRT包围。每个切除盒的最外层，即59和39整合序列，是位点特异性的，以确保仅在目标区域进行敲除。使用HPLC纯化引物和PhusionTM高保真DNA聚合酶，通过标准重叠延伸PCR扩增并连接所有部分。在AOX1敲除盒的情况下，AOX1启动子被放置在第一个FRT的59个位置，同时作为FLP重组酶的启动子和59整合序列。为了确保KU70基因的失活，起始密码子ATG也被修饰为ATAC。通过重叠延伸PCR将ZeocinTM抗性盒与59和39个位点特异性序列连接起来，对PCR产物进行纯化后克隆到pJET载体中，转移至毕赤酵母中，得到基因靶向效率显著提高的新菌株。
参考文献：Näätsaari L, Mistlberger B, Ruth C, Hajek T, Hartner FS, Glieder A. Deletion of the Pichia pastoris KU70 homologue facilitates platform strain generation for gene expression and synthetic biology. PLoS One. 2012;7(6):e39720.
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巴斯德毕赤酵母AOX1启动子来驱动由酿酒酵母CYC1终止子终止的酿酒酵母FLP重组酶的调节表达。从pPpT2扩增出ZeocinTM抗性盒。上述部分在两侧被直接放置的相同的34bp FRT包围。每个切除盒的最外层，即59和39整合序列，是位点特异性的，以确保仅在目标区域进行敲除。使用HPLC纯化引物和PhusionTM高保真DNA聚合酶，通过标准重叠延伸PCR扩增并连接所有部分。在AOX1敲除盒的情况下，AOX1启动子被放置在第一个FRT的59个位置，同时作为FLP重组酶的启动子和59整合序列。为了确保KU70基因的失活，起始密码子ATG也被修饰为ATAC。通过重叠延伸PCR将ZeocinTM抗性盒与59和39个位点特异性序列连接起来，对PCR产物进行纯化后克隆到pJET载体中，转移至毕赤酵母中，得到基因靶向效率显著提高的新菌株。
参考文献：Näätsaari L, Mistlberger B, Ruth C, Hajek T, Hartner FS, Glieder A. Deletion of the Pichia pastoris KU70 homologue facilitates platform strain generation for gene expression and synthetic biology. PLoS One. 2012;7(6):e39720.
