以灵芝的基因组DNA为模板，使用引物扩增出含有sdhB启动子和编码序列的DNA片段和包括sdhB编码和终止子序列的 DNA片段。随后，使用引物以及两个纯化的片段作为模板，通过PCR将这两个片段组合在一起，将PCR产物亚克隆到pMD18-T载体中，命名为pMD18TCBX，使用引物和Pfu DNA聚合酶从质粒pMD18TCBX中扩增出突变的sdhB盒，通过用PmlI和XhoI消化pBAMBIA1301，去除hph基因和gus基因，并通过钝端连接插入扩增的sdhB盒，制备了二元质粒载体pJW。以基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得灵芝gpd的启动子序列。使用引物从基因组DNA中扩增出灵芝HMGR基因的催化结构域。随后，使用引物以及两个纯化的片段作为模板，通过PCR将这两个片段结合形成一个的片段（Pgpd-tHMGR）。通过用XhoI消化pBARGPE1并在填充粘性端后插入PGPD-tHMGR片段，产生介导质粒pBAR-PGPD-tHMGR。最后，通过使用EcoRV和NotI从质粒pBAR-PGPD-tHMGR中切下PGPD-tHMPR-trpC终止子片段，并在质粒pJW的AseI位点通过钝端连接插入该片段，构建了质粒pJW-tHMGR。
参考文献：Xu JW, Xu YN, Zhong JJ. Enhancement of ganoderic acid accumulation by overexpression of an N-terminally truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene in the basidiomycete Ganoderma lucidum. Appl Environ Microbiol. 2012 Nov;78(22):7968-76.
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以灵芝的基因组DNA为模板，使用引物扩增出含有sdhB启动子和编码序列的DNA片段和包括sdhB编码和终止子序列的 DNA片段。随后，使用引物以及两个纯化的片段作为模板，通过PCR将这两个片段组合在一起，将PCR产物亚克隆到pMD18-T载体中，命名为pMD18TCBX，使用引物和Pfu DNA聚合酶从质粒pMD18TCBX中扩增出突变的sdhB盒，通过用PmlI和XhoI消化pBAMBIA1301，去除hph基因和gus基因，并通过钝端连接插入扩增的sdhB盒，制备了二元质粒载体pJW。以基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得灵芝gpd的启动子序列。使用引物从基因组DNA中扩增出灵芝HMGR基因的催化结构域。随后，使用引物以及两个纯化的片段作为模板，通过PCR将这两个片段结合形成一个的片段（Pgpd-tHMGR）。通过用XhoI消化pBARGPE1并在填充粘性端后插入PGPD-tHMGR片段，产生介导质粒pBAR-PGPD-tHMGR。最后，通过使用EcoRV和NotI从质粒pBAR-PGPD-tHMGR中切下PGPD-tHMPR-trpC终止子片段，并在质粒pJW的AseI位点通过钝端连接插入该片段，构建了质粒pJW-tHMGR。
参考文献：Xu JW, Xu YN, Zhong JJ. Enhancement of ganoderic acid accumulation by overexpression of an N-terminally truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene in the basidiomycete Ganoderma lucidum. Appl Environ Microbiol. 2012 Nov;78(22):7968-76.
