PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重...
如果是通过敲除的方法来确定基因的功能，理论上来说是需要进行回补实验的，一方面通过回补后表型的回复来确定该基因的功能，另一方面，也能保证你的敲除没有影响到其他基因的正常转录表达。必需进行基因回补。可以是低拷贝质粒，也可以插入染色体进行单拷贝回补。除需要进行基因回补实验，还要在通过体外生化实验验证功能，才能说明该基因的功能
、血球计数板法 （1）原理： 利用血球计数板在光学显微镜下，查出芽孢个数，再用公式计算出1克样品中含芽孢个数。 （2）仪器： 血球计数板（25×16格），光学显微镜，刻度吸管，三角瓶，振荡器和玻璃球. （3）方法和步骤： a、取样及样品制备：称取待测样品1克（精确到0.1克）装入盛有99毫升水的三角瓶中，然后用振荡器或加玻璃球摇匀，使菌液均匀分布。用刻度吸管自三角瓶吸取菌液1毫升，装入盛有9毫升水的试管或装有99毫升水的三角瓶中，摇匀（扩大稀释倍数）待用. b、制片：用吸管从摇匀的菌液中吸取少许菌液，从盖玻片一端注入25×16的血球计数板，使菌液沿玻片间隙...
如果构建的载体没有问题，出现卫星菌落一般考虑一下几个方面：一是抗生素出了问题；二是操作出了问题。抗生素放置时间过长或者温度过高，也可能是紫外线灯因素影响，会出现失效的可能。在加氨苄的平板上涂布菌液时，可能由于氨苄浓度太低或者局部菌液太多，出现卫星菌落情况。如果以上所有问题都已经排除还是出现卫星菌落，建议挑去卫星菌落中间较大的菌落，成功率也还是比较高的。 Amp通常情况是不会出现问题。出现卫星菌落对Amp抗性的菌是很正常的情况，是由Amp的抗性原理决定，看看pET载体使用手册中Amp的注意事项。
菌落数在30至300之间的平板计数最为理想。平板计数只记录满足以下条件的菌落:琼脂表面的菌落需要直径为1mm到5mm;白色到奶色，凸面，具有完整的边缘和光滑的表面。嵌在琼脂培养基中的菌落需要直径为0. 5mm-1mm在琼脂中具有奶色的点状体。 6.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(ml)样品中菌落总数结果。 6.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算: N= ∑C/ (n1+0.1n2)d.............
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