16S rRNA靶基因的DNA测序应用于菌种鉴定，依赖于迅速发展的互联网技术、计算机技术与分子生物学相结合而诞生的生物信息技术。世界范围内生物信息资源的交流、共享及在线核酸分析程序的开发，为细菌16S rRNA靶基因测序鉴定奠定了基础。目前，几乎全部原核生物的16S rRNA基因序列已测序成功并保存在公共核酸库中，且对于所有新命名的细菌，亦必须测序其16S rRNA基因并提交到公共核酸库中。因此，对于未知的细菌，只需要采用针对16S rRNA基因保守区的通用引物进行扩增和测序，再通过公共的核酸库进行核酸序列的Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih...

细菌的rRNA有5S、16S及23S三种，其中16S rRNA基因的编码序列常用于细菌的分类学研究。16S rRNA基因用于细菌的分类研究的优势有：①存在于所有的原核生物中，功能同源且最为古老，素有“细菌化石”之称；②分子量约1540核苷酸，大小适中、易于操作；③由不连续保守区和可变区组成，其保守区可用于通用引物设计，可变区可推测其分类学地位。

①漂浮集菌法：痰标本经121℃高压灭菌15分钟，待冷后，取5～10ml盛于体积为100ml的玻璃容器中（口径约2cm），加灭菌蒸馏水20～30ml，总体积勿超过容器的1/3，加二甲苯0.3ml，置振荡器振荡10分钟，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载物玻片盖于瓶口上，静置20分钟，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检；②离心集菌法：痰标本经121℃高压灭菌15分钟，待冷后，取5～10ml盛于体积为50ml的离心管中，加灭菌蒸馏水至50ml，经3000g离心20分钟后，取沉淀涂片染色镜检。 参考TSU.TW原文：https://www.tsu.tw/edu/8535.ht...

比例法是世界卫生组织（WHO）全球结核病耐药监测项目统一推荐的方法。目前常用接种方法有接种环法和移液管法。 一、接种环法 接种环应是铂金环，铂金环的内径为3mm，每环可以移液0.01ml（必须经过称量滤纸方法进行校准）的菌悬液。用接种环取2满环10−2mg/ml的菌悬液移至装有2ml蒸馏水的小试管，振荡混匀，即配成10−4mg/ml的菌液。用接种环分别将10−2mg/ml和10−4mg/ml的菌悬液接种一环于含药培养基和对照培养的斜面，接种菌量为10−4mg 和10−6mg。 二、移液管法 将配好1mg/ml菌悬液静置片刻，使其中的颗粒或菌块沉淀，取0.5ml上述1mg...

CRISPR Cas9定点切割基因组DNA，然后由Red重组酶进行修复。未能修复成功的大肠杆菌因基因组DNA断裂死亡，修复成功的个体即编辑成功的个体得以存活。CRISPR Cas9系统可以真正做到无痕基因编辑。与Red同源重组系统相比，CRISPR Cas9系统由于其独特的无标签筛选阳性克隆的机制，在进行需要很高精确度的定点突变中有较大优势。

Red同源重组系统是来自lambda噬菌体的重组系统。该系统在pKD46载体表达Gam，Exo，Beta三个蛋白，实现将外源DNA同源重组到大肠杆菌基因组。该系统成熟高效，可以实现基因敲入、敲除。我们公司在Red重组系统的基础上加入Cre-loxP系统对插入的筛选抗性基因进行清除，基本实现无痕编辑。