用Primer Premier 5(Primer 5)来设计,主要参考了Takara的试剂盒说明书上对于引物设计的要求(如图)。其他就是普通PCR引物的要求了,而这些只要看引物设计软件的评分就可以了,评分越高越好。我自己用Primer Premier 5设计,大部分都是95分以上的才用。如果是用Sybr Green,由于双链DNA都会引起荧光信号,所以尽量不要有错配、二聚体、发夹结构这些东西,在这里,这些比Tm值、GC含量还要重要些。实在免不了,那么其结合强度也不能高。可以看评分里面的AG值(如图),绝对值越大,结合强度越大。具体的我不是很清楚,只记得以前生物信息学上老...