兔是建立慢性鼻窦炎动物模型的理想选择。新西兰兔上颌窦具有与人类相似的解剖学特征（图1），其窦腔容积和窦口位置适宜模拟人类鼻窦的通畅与阻塞状态，便于实施不完全堵塞及窦腔注射等操作；同时兔鼻窦黏膜的纤毛结构及炎性反应模式与人类具有高度相似性，能够在组织学和超微结构层面有效反映慢性鼻窦炎的病理演变过程。此外，兔体型适中，便于CT影像学随访和鼻内镜检查，且饲养成本较低、耐受性好，能够满足6周以上慢性病程观察的需要。基于上述优势，本实验选用新西兰兔建立金黄色葡萄球菌感染性慢性鼻窦炎模型。
图1 人类和兔子鼻窦解剖比较
（引自Ahmed AAl-Sayed发表的公开研究文献）
1 材料
1.1 材料与仪器
实验动物： 健康新西兰兔45只，体重1.5~3.0 kg，雄雌不限。
主要仪器： 体重秤、摇床、恒温培养箱、酶标仪、鼻部CT扫描仪、0°鼻内窥镜、离心机、光学显微镜、扫描电子显微镜、冰冻切片机。
主要试剂与耗材：10%水合氯醛溶液、利多卡因（1%）/肾上腺素（1:100000）注射液、碘伏、无菌棉絮、0.9%生理盐水、10%中性多聚甲醛、2.5%戊二醛溶液、5%稀盐酸、石蜡、二甲苯、苏木精染液、伊红染液、甲醇（梯度浓度）。
1.2 细菌培养
（1）使用无菌接种环挑取适量冷冻保存的标准金黄色葡萄球菌菌种，接种于培养基上，置于37°C培养箱中活化培养24 h。
（2）手术当日早晨，取40 mL新鲜培养基（37°C）置于宽底锥形瓶中，于摇床上振荡培养。加入过夜活化的菌液，调节初始光密度（OD）至0.04～0.06之间，继续培养。
（3）每20～45 min使用酶标仪测定一次OD值，直至OD≈0.3（对数生长期）时置于冰上终止生长，于4°C、4000 r/min条件下离心15 min，共洗涤两次。
（4）弃上清，将沉淀重悬于1 mL 0.9%生理盐水中，置冰上保存。逐滴加入含2 mL生理盐水的比色杯中，调至OD≤0.6。吸取0.4 mL该菌悬液分装于1 mL注射器中，置于冰上备用（手术当天使用）。
2 方法
2.1 实验动物及分组
45只新西兰兔适应性饲养1周后，随机分为3组：实验组（上颌窦不完全堵塞+金黄色葡萄球菌接种）20只[1]、对照组（单纯上颌窦不完全堵塞）20只、空白对照组5只。所有动物于标准环境分笼饲养，自由饮水进食。
2.2 动物建模
（1）麻醉与术前准备： 实验动物称重后，腹腔注射10%水合氯醛溶液（500 mg/kg）麻醉，监测生命体征（呼吸、脉搏）。固定后行鼻部CT扫描，排除鼻腔鼻窦病变。除空白对照组外，其余动物鼻背部去毛备皮，常规消毒铺巾。
（2）局部麻醉： 术区皮下注射1.5～2 mL含肾上腺素（1:100000）的1%利多卡因行局部浸润麻醉。
（3）手术操作（左侧上颌窦）： 沿鼻背中线纵向切口，分离皮下组织，于上颌窦前壁中线外侧1.0 cm处切开骨膜，分离0.5 cm×0.5 cm骨膜瓣，置于温生理盐水中备用。使用微钻钻取直径约3 mm的骨孔，生理盐水冲洗术腔，留取冲洗液行细菌培养。经骨孔置入0.5 cm×0.5 cm×1 cm无菌棉絮于窦腔内，造成不完全阻塞[2]（图2）。
图2 建模过程的关键步骤
（a.在上颌窦前外侧壁切开并钻孔；b.将明胶海绵插入上颌窦；c.脓痂附着在模型侧前鼻孔（黑箭头），切口已经完全愈合。引自 Yongwei Guo发表的公开研究文献）
（4）接种： 实验组兔用注射器吸取配置好的0.4 mL金黄色葡萄球菌悬液，经骨孔缓慢注入窦腔。
（5）缝合： 术区碘伏消毒，将预留骨膜瓣覆于骨孔上，逐层缝合骨膜及皮肤（图3）。
图3 造模过程示例图[1]
（A.在术侧上颌窦前外壁钻孔；B.将棉絮插入左上颌窦腔；C.注射金葡菌菌液；D.逐层缝合。）
2.3 体征观察
术后每日观察各组动物的精神状态、进食量变化，以及有无打喷嚏、流脓涕、溢泪、结膜充血等局部感染征象和全身感染表现。实验期间所有动物不予抗生素干预，以避免干扰生物膜形成[3]。
2.4 鼻窦CT和鼻内镜检查
术后6周，于麻醉下行鼻窦冠状位连续CT扫描（层厚1 mm）(图4)，评估上颌窦密度变化；并行双侧鼻腔内镜检查，观察中鼻道分泌物及黏膜情况。
图4 CT图像扫描示例图
(1、2和3显示患病兔有慢性上颌窦炎。引自Rena MacFarlane发表的公开研究文献）
2.5 样本采集及检测
二次影像学检查完成后，充分暴露手术侧上颌窦腔。
（1）首先取窦腔分泌物行细菌分离培养，种于血平板及金黄色葡萄球菌显色培养基，37℃培养24～48 h，经革兰染色及凝固酶实验鉴定菌种，记录阳性率。
（2）完整剥离上颌窦黏膜，置温生理盐水中漂洗，将黏膜标本分为两部分。
（3）HE染色光镜观察：组织分别经10%中性多聚甲醛固定24 h，5%稀盐酸脱钙12 h，石蜡包埋，连续切片（厚度4 μm），二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精染色5 min，伊红染色2 min，常规脱水、透明、封片，光镜下评估炎性细胞浸润程度、纤毛排列及结构完整性。
（4）扫描电镜观察：组织经梯度甲醇脱水、CO₂临界点干燥，安装于扫描电镜柱，金靶溅射镀膜（厚度12 nm），于20 kV加速电压下观察纤毛排列及生物膜形成情况。
（5）动物经耳缘静脉空气注射处死。
3 判定标准
造模成功的判定采用双硬性指标联合否决制：必须同时满足术侧上颌窦腔分泌物金黄色葡萄球菌培养阳性，以及光镜下黏膜固有层呈现中至重度慢性炎性细胞（淋巴细胞、中性粒细胞）浸润且纤毛排列紊乱或脱落。两项均符合方为建模成功，任意一项阴性即判定失败并剔除该动物[4]。
术后出现术侧脓涕、打喷嚏、溢泪等体征（图5）、CT示窦腔密度增高以及扫描电镜见纤毛成簇、稀疏或上皮裸露等改变（见表1），仅作为辅助性参考佐证[5]，用于支持炎症存在或生物膜形成判断，但不具独立判定效力，亦不能替代上述两项核心指标。
图5 患病图示例图
（感染图上颌窦术前侧壁隆起，形成脓肿，脓肿先后溃烂溢出白色粘稠脓液，骨质增生。引自林彬发表的公开研究文献）
表1 组织病理学判定
项目 | 正常表现 | 炎症表现（阳性） |
黏膜上皮 | 纤毛排列整齐的假复层柱状上皮 | 纤毛排列不齐/部分脱落 |
杯状细胞 | 散在少量 | 数量明显增多 |
间质 | 无明显水肿 | 间质水肿 |
腺体 | 正常分布 | 腺体增生 |
炎性细胞 | 偶见 | 大量淋巴细胞、中 |
对照组若培养出杂菌（如表皮葡萄球菌）或仅见轻度炎症反应，但未达中重度且非目标菌金黄色葡萄球菌，则不视为造模成功。实验组所有纳入统计的动物必须同时满足两项硬性标准，否则予以剔除，以确保数据可靠性。
参考文献
[1] 林彬,王挥戈,林心强,等.兔慢性鼻窦炎模型建模方法的比较与优化改良[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2005,(5):343-346.
[2] Jia M, Chen Z, Du X, et al. A simple animal model of Staphylococcus aureus biofilm in sinusitis[J]. American Journal of Rhinology & Allergy, 2014, 28(2): e115-e119.
[3] Perloff J R, Palmer J N. Evidence of bacterial biofilms in a rabbit model of sinusitis[J]. American journal of rhinology, 2005, 19(1): 1-6.
[4] 李元惠.细菌生物膜阳性的慢性鼻窦炎兔模型的建立[D].山西医科大学,2018.
[5] Ha K R, Psaltis A J, Tan L, et al. A sheep model for the study of biofilms in rhinosinusitis[J]. American journal of rhinology, 2007, 21(3): 339-345.
