你好,请登录   免费注册    |    收藏本站
联系电话: 0574-87917803

                                                                                                                                     假病毒包装

一、假病毒简介

慢病毒:慢病毒(LentivirusLV)是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,属于逆转录病毒,区别一般的逆转录病毒载体,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,因此具有广阔的应用前景。

腺病毒:腺病毒(AdenovirusADV)是一种没有包膜的直径为7090 nm的病毒颗粒,具有较强的细胞和组织感染能力,腺病毒载体能够携带大容量的基因片段,适用于短时间内高表达的相关实验,可以快速获得目的产物,效率高。

腺相关病毒:腺相关病毒(Adeno-associated virusAAV,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。研究过程中采用的重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

二、慢病毒的储存和稀释:

 1:储存条件:-80℃可保存12个月左右,如果超过12个月,则病毒滴度下降可能较多,最好再使用前重新做滴度测定。4℃一般可储存1-2周。注意:慢病毒使用时要注意避免反复冻融,如需要多次使用,请将病毒分装后储存在-80℃

2:慢病毒稀释:在使用前,将慢病毒冰浴融化或4℃冰箱融化,融化后放置在冰盒上备用。用完全培养基或

PBS稀释。稀释后的病毒请立即使用,不建议再分装冻存。

3:泰斯拓生物提供的慢病毒滴度单位为TU/ml,即每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。“TU”“Transducing-Units”的缩写,中文为转导单位,表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。如:病毒滴度为1×108TU/ml,即每毫升病毒液中含有1×108个具有生物活性的病毒颗粒。


三、特殊细胞感染注意事项

1:悬浮细胞

悬浮细胞感染可以采用离心感染法,在培养皿中加入病毒后,可以将培养板子密封,然后使用水平转子1000g离心1h,再放回培养箱中培养,这样可以增加病毒与悬浮细胞的接触概率,从而提高感染效率。

2:极难感染的细胞

有些细胞很难感染,那么单次感染之后的效率很低的情况下,可以采用多次反复感染的方法来提高感染效率,即在进行一次感染之后,重新加入新鲜病毒再次感染,一般在加强感染之后,可以显著提高细胞的感染效率。但在两次感染之间,要注意调整好细胞状态,因为病毒在感染细胞之后是存在细胞毒性的,会影响细胞的生长状态。

3:原代细胞

对于原代细胞,一般细胞生长比较缓慢,且其传代能力较差,所以在接种的时候,可以提高细胞密度在50%以上。

4:非分裂细胞

对于一些非分裂细胞,其复苏或接种后细胞不再分裂增殖,所以在进行感染时,细胞的密度得在80%以上,所以在复苏或者接种时就得注意把细胞密度铺在80%以上。

最适MOI预实验

5:贴壁细胞

(1):感染前一天,用胰酶消化目的细胞并计数,然后将细胞接种到96孔板,培养基体积为100µl,使得第二天进行病毒感染时的细胞汇合度20-30%左右。对于大部分细胞,我们通常认为培养24h后细胞数量是铺板数量的两倍。

(2):MOI值的设置若有文献参考,可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值;若无文献参考可按照MOI 1,10,50,100设置MOI梯度进行摸索。

(3):根据细胞数,按照MOI 1,10,50,100计算出需要加入的病毒滴度(最适MOI预实验一般选用荧光对照病毒),然后使用含有终浓度为8ug/ml左右的polybrene(Cat.TA003)的完全培养基在对应的EP管里进行稀释,总体积为100µl。吸掉各孔中上清液,更换为稀释好的不同MOI的病毒液,混匀,继续培养。感染后24h后用完全培养基进行换液,过程中观察细胞形态,发生变化时可以提前到8h换液,保持细胞正常生长。

(4):感染后约72h,观察感染效率。根据后续实验内容,选择合适时间点进行实验。可按照实际感染情况,校正MOI。

(5):最适MOI的选择原则:1):细胞状态不受影响,2):尽量用较少的病毒,3):选择感染效率80%左右的感染条件作为最佳感染条件。

6:悬浮细胞

(1):感染前一天,制备悬浮细胞悬液,细胞密度约为1*10^5个/ml将细胞接种到96孔板。

(2):MOI值的设置若有文献参考,可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值;若无文献参考可按照MOI 1,10,50,100设置MOI梯度进行摸索。

(3):根据细胞数,按照MOI 1,10,50,100计算出需要加入的病毒滴度(最适MOI预实验一般选用荧光对照病毒),然后使用含有终浓度为16µg/ml左右的polybrene(Cat.TA003)的完全培养基在对应的EP管里进行稀释,总体积为100µl。然后将不同MOI的病毒稀释液加到对应的96孔中,混匀,继续培养。感染后24h后再加入100µl完全培养基,以保持细胞正常生长,过程中观察细胞形态。

(4):感染后约72h,观察感染效率。根据后续实验内容,选择合适时间点进行实验。可按照实际感染情况,校正MOI。

(5):最适MOI的选择原则:1):细胞状态不受影响,2):尽量用较少的病毒,3):选择感染效率80%左右的感染条件作为最佳感染条件。